重组水蛭素的原核表达及分离纯化

为了提高水蛭素的生产效率以适应生物医药应用的需求,试验通过对水蛭素基因进行密码子优化,构建了重组水蛭素原核表达系统,并对D_{600 nm}值、诱导时间、诱导剂IPTG浓度和诱导温度4种诱导条件进行了探索,同时通过引入试验设计（design of experiment,DOE）方案将4种因素对诱导效率的影响进行进一步系统的优化,使用His-Trap亲和层析对重组蛋白进行纯化,并通过凝血酶滴定法对重组水蛭素的活性进行测定。结果显示,试验成功构建重组水蛭素原核表达载体,水蛭素蛋白为可溶性表达。单因素变量优化后的诱导条件为：在菌体密度D_{600 nm}值为0.4时,加入1 mmol/L IPTG,37℃下诱导7 h,重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白66.5%;而DOE试验优化结果为：在菌体密度D_{600 nm}值为0.6时,加入0.82 mmol/L IPTG,31.9℃下诱导7.6 h,预测重组水蛭素蛋白表达效率最高,占菌体总蛋白72.7%,显著高于单因子变量法优化结果（P<0.05）。进一步分析发现,各影响因素之间存在明显的交互效应,影响了单因素试验结果的准确性。通过亲和层析纯化后的重组水蛭素纯度可达99%,抗凝活性为114 ATU/mg。研究成功构建了重组水蛭素原核表达载体,对其表达条件进行了优化,并获得了重组水蛭素蛋白,为水蛭素应用于生物医药奠定了基础。     

人脂联素原核表达纯化及活性检测

为了克隆人脂联素基因(ACRP30),获得有免疫活性的重组人脂联素,以人皮下脂肪组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到ACRP30基因.构建重组质粒pET-CKS-ACRP30,转化表达茵BL21(DE3),以IPTG诱导表达人脂联素重组蛋白,利用镍亲和层析纯化,Western blot鉴定其活性,双抗体夹心法...     

猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化

以pcDNA3．1-pIL-18为模板，采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18（IL-18）的成熟蛋白基因，通过KpnⅠ＋SacⅠ双酶切及连接反应，构建了pET32c—pIL—18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实，重组质粒中的基因片段连接正确。之后，重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃、1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子质量约为33ku处出现了预期的目的蛋白。用8mol／L脲对表达产物变性，经Ni^2＋NTA柱纯化，透析复性，得到了纯化的IL-18蛋白。Western—blot分析证实，纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

重组奶牛神经肽Y基因的原核表达载体的构建、表达及纯化

<正>在奶牛的饲养过程中,由于高产品种的引进、培育,高能饲料的开发、利用,规模化饲养程度的提高等众多方面的原因,使得酮病和脂肪肝的发病率长期以来一直居高不下。我国奶牛酮病的发病率占泌乳牛的15%～30%,脂肪肝的发病率超过30%,又     

狂犬病病毒糖蛋白原核表达及纯化

试验旨在提高狂犬病病毒(rabies virus,RV)糖蛋白(G)在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中的表达量。通过优化蛋白质诱导表达的温度、时间、诱导剂浓度等条件,以提高该蛋白质的表达量。SDS-PAGE电泳分析结果显示,重组质粒在1 mmol/mL IPTG、30 ℃诱导6 h条件下蛋白表达量最高,经GST-resin亲和层析柱法纯化获得的纯化蛋白约为36 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示,表达蛋白具有很好的免疫原性和特异性。结果表明,RV G融合蛋白的优化表达和纯化为RV亚单位疫苗及中和抗体的研制奠定了基础。     

马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

鸡α干扰素的原核表达及纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化,全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒p ET-23b-Ch IFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在,包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、WesternBlot分析表明,Ch IFN-α蛋白得到了高效表达,其蛋白分子质量约19 k D,经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白,其含量为0.82 mg/m L。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。     

蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因，并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株，分别在1．0mmol／LIPTG、37℃和0．1mmol／L IPTG、28℃条件下诱导，蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达，且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。     

人表皮生长因子的原核表达及纯化

为了利用特殊表达载体在大肠埃希氏菌中表达融合表皮生长因子(EGF)并进行纯化工艺研究,试验采用PCR扩增EGF,克隆至p ET-SUMO-T载体中,构建重组表达质粒p ET-SUMO-TEGF,转化大肠埃希氏菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的蛋白经SDS-PAGE分析,利用Celating SepharoseTMFast Flow金属螯合层析介质、Q Sepharose High performance阴离子交换层析介质以及Superdex 200 prep grade分子筛对表达蛋白进行纯化,期间采用SephadexTMG-25 Fine介质进行脱盐、SUMO蛋白酶切割His.tag标签。结果表明:重组质粒经PCR鉴定及测序证明构建正确;表达的EGF蛋白分子质量为6 ku,主要以可溶形式表达,表达量占菌体总蛋白的45%以上;纯化的EGF蛋白纯度达到95%。说明成功在大肠埃希氏菌中表达并经过简易工艺纯化了重组EGF。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

犬β-防御素cBD103的原核表达和纯化

将犬β-防御素103(canineβ-defensin 103,cBD103)基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-cBD103,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达后,利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,并用肠激酶酶切融合蛋白,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物。结果表明,质粒pET-cBD103经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,大肠埃希菌中成功表达出目的蛋白,蛋白大小约为24ku,以可溶性表达为主。经过纯化和酶切,得到大小8ku的cBD103,与预期大小一致。该研究在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,为下一步大规模制备cBD103奠定了基础。     

结核分枝杆菌ACR蛋白的原核表达及纯化

为获得区别结核感染状态的血清学鉴别诊断试剂的抗原,根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的ACR基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,PCR扩增得到ACR基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,得到载体pGM-T-ACR.分别将pET32a质粒和pGM-T-ACR质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,并将纯化的ACR基因亚克隆至pET32a中,获得重组表达质粒pET32a-ACR.将其转化E.coli BL21 IPTG诱导后,经SDS-PAGE、western blot分析鉴定,可见约34 ku的外源蛋白带.表明ACR基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的ACR融合蛋白.     

重组鲢鱼抗菌肽parasinⅠ原核表达、纯化与抗菌活性

本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%～50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。     

狂犬病毒HEP-Flury株基质蛋白的原核表达及纯化

为原核表达狂犬病毒(RV)基质蛋白(M),本研究以RV的HEP-Flury株全长重组质粒为模板扩增M基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE-M并转化至宿主菌E.coli M15(pREP4),在IPTG的诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示M蛋白为25ku。Western blot检测证明,重组蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及鼠抗狂犬病毒多克隆抗体特异识别。本研究为狂犬病诊断方法的建立奠定了基础。     

泰勒虫重组抗原Tams1-spag基因原核表达与纯化

为了在低成本的情况下,得到高浓度、高纯度的环形泰勒虫表面重组抗原的融合蛋白,设定表达过程中不同的OD600nm、IPTG浓度与诱导时间,探索最佳表达条件。通过KCl染色法切胶后分别经透析袋电洗脱法与快速离心法回收目的蛋白。对上述试验的蛋白样品进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果表明,在OD600nm=1时加入浓度为1mmol/L IPTG,过夜诱导时,重组蛋白的表达量最大。在KCl染色法切胶回收目的条带的基础上,电洗脱法与快速离心法均能得到同等浓度的高纯度目的蛋白,经Western blot检测重组蛋白的生物活性没有改变,仍具有良好的反应原性。     

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白的原核表达及纯化

本试验旨在表达并纯化鞭毛蛋白,为研究并获得高效蛋白佐剂奠定基础。用PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fljB、fljB’和fliC,将扩增产物克隆至pMD19-T Simple Vector上,构建了克隆质粒pMD19-fljB、pMD19-fljB’和pMD19-fliC。克隆质粒经双酶切后将片段克隆至pET-30a中,构建原核表达质粒pET30a-fljB、pET30a-fljB’fliC和pET30a-fliC。经PCR、酶切及测序鉴定后将阳性表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达后的菌体经超声处理取上清,用Ni柱进行纯化。Western blotting证实了表达的蛋白能与豚鼠抗鞭毛蛋白血清发生特异性反应。通过优化表达条件,鞭毛蛋白fljB、fliC和fljB’fliC均以可溶性表达,纯化得到的鞭毛蛋白为后续评价其佐剂效应奠定基础。