广灵驴成纤维细胞系的建立及其相关生物学特性研究

试验旨在建立广灵驴成纤维细胞库,以期在细胞水平上对广灵驴进行保护。本研究以1月龄广灵驴耳缘皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行成纤维细胞培养,建立了广灵驴耳缘皮肤组织成纤维细胞系,并对其相关生物学特性进行了鉴定。结果发现,试验所建立的广灵驴成纤维细胞系大多数细胞呈长梭形,部分细胞呈三角状或星型。在培养过程中,广灵驴原代成纤维细胞在贴壁4 d时开始有细胞从组织边缘游离出来,贴壁14 d后,细胞汇合率达到80%,可以进行第一次传代培养;细胞生长态势良好,生长曲线呈典型的S型曲线;细胞冻存复苏后活率有所下降,但生长状态良好。细胞分裂中期染色体数2n=62,说明成功建立了广灵驴成纤维细胞系。通过本方法建立的广灵驴成纤维细胞系为后续广灵驴的相关研究奠定了基础。     

金华猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

试验以金华猪耳缘皮肤组织为材料,采用组织块贴壁法进行耳缘组织分离、培养、传代,并进行细胞形态观察、细胞冻存前和复苏后存活率测定、生长曲线绘制等生物学特性研究。结果表明:金华猪耳缘组织成纤维细胞呈典型的成纤维细胞形态;细胞冻存前和复苏后存活率分别为95.6%和93.8%;生长曲线呈"s"型。通过试验建立了稳定的金华猪耳缘组织成纤维细胞培养方法,说明组织块贴壁方法是获得成纤维细胞的简单有效方法,获得的细胞可在体外至少传代10代以上,能为体细胞克隆、转基因和异种器官移植等相关研究提供核细胞来源。     

民猪耳皮成纤维细胞分离培养及生物学特性

为了研究民猪耳皮成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以1日龄民猪耳皮组织为试验材料,细胞原代培养采用组织块贴壁法,成纤维细胞纯化采用胰酶消化法和差速贴壁法,建立民猪耳皮组织成纤维细胞系,同时将细胞液氮冷冻长期保存。结果表明,成纤维细胞生长曲线呈"S"形,冻存前后活率均在90%以上。该试验成功建立了民猪成纤维细胞体外分离和培养方法。     

东北野猪耳皮成纤维细胞系的建立及生物学特征

研究了东北野猪耳皮组织成纤维细胞的分离、培养、纯化方法和生长特性,并对培养细胞进行了污染检测及冷冻保存和复苏培养观察.结果显示:原代培养在接种5d组织块边缘开始游离出单个细胞,到10d细胞生长旺盛;用酶消化法和差速贴壁法得到纯化的东北野猪成纤维细胞;冷冻前和复苏后的细胞活率分别为96.7％和92.7％,差异不显著(P＞0.05);分离纯化的东北野猪成纤维细胞生长曲线正常;支原体和病毒检测呈阴性;成功建立东北野猪成纤维细胞系.     

藏野驴皮肤成纤维细胞分离培养及生物学特性分析

为了研究藏野驴成纤维细胞分离培养方法及生物学特性,以7岁龄藏野驴耳部皮肤组织为试验材料,采用组织块贴壁法进行细胞原代培养,采用胰酶消化法和差速贴壁法进行细胞纯化,通过细胞形态观察、生长曲线测定、细胞周期和免疫荧光染色对细胞进行鉴定。结果显示,成纤维细胞生长曲线呈“S”形,细胞生长状态良好,细胞特异性标记免疫荧光染色显示FSP-1呈阳性表达。结果表明,成功建立了藏野驴成体耳部皮肤成纤维细胞体外分离、培养和鉴定方法,为藏野驴种质资源保护、细胞水平及分子水平的研究奠定了基础。     

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测。结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10~13 d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体（2n=38）占主体,约占细胞总数的84%,符合细胞建系的要求;脂质体（Lipofectamine^TM 2000）转染绿色荧光蛋白质粒（pEGFP-C1）的转染效率为25%。马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法。     

鲁西黄牛皮肤成纤维细胞分离与培养的研究

研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的分离与培养、纯化方法及生长特征,获得了传代培养的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞和上皮细胞.鲁西黄牛耳皮肤细胞在体外培养时呈贴壁生长,其原代或早期传代培养物由上皮样细胞与成纤维细胞混合组成.传代培养混合生长的细胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化处理3～4 min,脱壁悬浮的主要为成纤维细胞.采用反复消化法在传代过程中将二者逐步分离纯化,获得了可正常传代的鲁西黄牛耳上皮细胞系和成纤维细胞系.通过绘制生长曲线研究了鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞的增殖规律.传代培养至12代的鲁西黄牛皮肤成纤维细胞染色体倍性正常.利用第6代成纤维细胞作核供体克隆试验结果证明重构胚体外发育正常,囊胚发育率为27.3%.     

鸽胚胎成纤维细胞系的构建及生物学特性研究

(目的)为了研究鸽肌肉发育特点,本试验采用组织贴壁法成功培养白羽王鸽成纤维细胞系。(方法)本研究选用白羽王鸽第10日龄胚胎的腿部肌肉组织,采用组织块贴壁培养法进行原代细胞培养,在原代培养第3天开始进行细胞计数,建立其生长曲线,通过细胞冻存和复苏分析细胞活力。(结果)结果表明,贴壁后的细胞呈特征的梭型,多星型,彼此间紧密连接,生长状态良好,细胞生长曲线呈"S"型。细胞复苏率达到80%以上。(结论)通过组织块培养法,已成功建立白羽王鸽鸽胚的成纤维系,为深入研究与鸽肌纤维发育相关的基因功能提供良好的实验平台。     

不同年龄二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性

采用胶原酶消化法建立细胞系,观察细胞形态、测定细胞冻存前和复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线,并对染色体核型进行分析,研究不同年龄的二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性,分析年龄对二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞体外培养的影响。试验结果表明,年龄对细胞形态无影响;冻存没有降低细胞的存活率(P0.05);细胞的生长曲线呈典型的S型且年龄对细胞的生长无明显影响(P0.05);染色体核型分析显示,不同年龄的山羊耳组织成纤维细胞系的染色体数目均为2 n=60(XY/XY),无染色体畸形。说明不同年龄,甚至年龄比较大的二狼山绒山羊个体(13岁)都可以通过胶原酶消化法建成稳定的成纤维细胞系,本试验使二狼山绒山羊种质资源在细胞水平得到保存,为二狼山绒山羊成纤维细胞系的建立以及开展其种质资源的保存提供一定的参考。     

撒坝猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

实验采用撒坝猪耳缘组织块贴壁培养法首次对撒坝猪成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了撒坝猪耳缘成纤维细胞系;并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行分析;还利用透射电镜观察了耳缘组织细胞。结果表明:细胞倍增时间为48 h,生长曲线为"S"型;染色体中正常二倍体染色体(2n=38)所占比例为92.56%;细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染检测均显示为阴性。透射电镜观察显示,成纤维细胞呈长梭型。     

滩羊肾和耳缘组织细胞的分离培养与鉴定

用胰蛋白酶热消化分离并培养肾组织原代细胞,组织块法培养耳缘组织原代细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查。结果发现,滩羊肾和耳缘细胞呈成纤维形,平均复苏活力94.5%和97.7%,生长均良好,生长曲线均呈"S",最大增殖浓度和倍增时间分别为2.8×105/mL、25.5 h和3.2×105/mL、24.2 h,保存的细胞经细菌、真菌、病毒和支原体检查为阴性,染色体为2n=54,二倍体占主体。本研究,滩羊肾和耳缘组织细胞成功分离培养并保存,使滩羊这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

晋中绵羊耳成纤维细胞系建立

以晋中绵羊耳缘组织为材料,采用组织块贴壁培养法,通过原代培养和传代培养对细胞进行了细胞形态学观察、细胞计数和生长曲线的绘制,探讨了细胞体外培养模式.结果:细胞生长总体趋势呈“S”型;建立了晋中绵羊耳成纤维细胞系,细胞系的建立,使晋中绵羊的重要种质资源在细胞水平上保存下来.     

青海大通马耳缘组织成纤维细胞系的建立及生物学特性研究

为了建立青海大通马耳缘组织成纤维细胞系,使青海大通马这一重要种质资源在细胞水平上得以保存,试验采集青海大通马耳缘组织用组织块法制备原代细胞,通过差速消化法和差速贴壁法纯化细胞,扩大培养至第3代用液氮保存,细胞复苏后进行了活力、形态、生长曲线、微生物污染、核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性研究。结果表明:大通马耳缘组织原代和传代细胞呈成纤维型,生长良好,最大增殖浓度为4.27×105/mL,倍增时间为31.02 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性;染色体2n=64,二倍体率为80%,占主体;红色荧光蛋白质粒在该细胞中能进行复制和表达。     

辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞系的建立

为了成功建立绒山羊胎儿成纤维细胞系,利用核移植法获取转基因绒山羊,试验采用组织块贴壁法和细胞冷冻技术,并根据上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,采用酶消化法纯化细胞获得成纤维细胞系S1和S2,并对该细胞进行性别鉴定、生长曲线测定与核型分析。结果表明:该供体细胞S1为雌性,S2为雄性,其生长旺盛,状态良好,核型正常,有30对染色体。说明试验成功建立了辽宁绒山羊胎儿成纤维细胞的体外培养体系,可用于通过核移植法获取高产绒量的转基因绒山羊。     

转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系的建立及鉴定

本试验采用组织块贴壁法对初生仔猪的耳组织进行原代培养,成功分离出转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞,并对细胞进行形态学观察,冻存前和复苏后细胞活力检测,生长动力学分析,波形蛋白免疫组化,染色体计数以及微生物污染检测等生物学特性分析。结果表明,原代细胞经过胰蛋白酶消化和差速离心分离培养出成纤维细胞,7组细胞冻存前细胞活力均在为92%以上,冻存3个月后细胞复苏活力仍在89%以上;细胞生长总趋势呈"S"型,即经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段;细胞波形蛋白免疫组化在成纤维细胞中呈阳性反应;染色体计数结果表明,染色体数量稳定;成纤维细胞的细菌、真菌、病毒和支原体检测均为阴性。本试验成功建立了转pGH基因猪与非转基因猪成纤维细胞系。     

德国牧羊犬成纤维细胞培养及其生长特性研究

试验旨在探讨犬耳部和腹部皮肤成纤维细胞体外培养和纯化方法,为下一步犬体细胞核移植提供基础。结果表明,在组织块培养后的4 d,耳组织周围开始有细胞出现,8~10 d呈优势生长,2周后可长满细胞瓶。腹部皮肤组织则要6~7 d方可见有细胞沿组织块周围爬出,10 d左右可以在组织块周围形成成片细胞,20 d左右可以长满整个细胞瓶。腹部皮肤成纤维细胞建系初期生长速度低于耳成纤维细胞,但传代至第4代时,两种细胞的生长曲线基本相同。     

早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定

为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞。结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快;用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8%)＞耳(94.7%)。2种组织成纤维细胞生长曲线均呈"S"型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h)。用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应。     

郏县红牛耳成纤维细胞的建立

以郏县红牛耳缘组织为试验材料,采用组织块贴壁法培养,成功建立郏县红牛成纤维细胞系,对其进行细胞形态、细胞活力、生长曲线、染色体核型分析及微生物检测等生物学特性研究。结果显示:细胞形态为典型的成纤维细胞,生长曲线呈S型,细胞倍增时间为39h,冻存前和细胞复苏后活力为98%以上;细胞染色体2n=60,细胞株1-P9、1-P14及2-P9二倍型比例为89.86%、73.82%、78.02%;细菌、真菌、病毒及支原体检查均为阴性。结果表明该细胞系的建立实现了郏县红牛遗传资源在细胞水平上的成功保存。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

新疆驴成纤维细胞原代培养及鉴定

为了获得纯度较高的驴皮成纤维细胞并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采用组织块贴壁法进行原代细胞培养,用胰蛋白酶联合组织块进行差时消化法分离、纯化成纤维细胞,并通过细胞形态观察、PCR扩增鉴定vimentin、免疫荧光染色法鉴定分离的细胞并计算纯度,用CCK-8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存前后的细胞活率。结果表明：分离纯化后的细胞呈梭形或纺锤形,具备典型的成纤维细胞形态;PCR扩增可清晰检测到vimentin的表达条带;细胞免疫荧光显示vimentin染色为阳性,DAPI核染呈椭圆形,以上方法均鉴定为成纤维细胞;体外培养的驴皮第3代成纤维细胞48 h后进入对数生长期,其生长曲线呈“S”型;冻存前和复苏后细胞活率差异不显著(P>0.05)。说明经体外分离、纯化成功获得了驴皮成纤维细胞。