表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA的构建及免疫效果研究

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的质粒DNA,并测定其免疫效果。将猪附红细胞体ENO基因克隆到PVAX1真核表达载体上,然后转染到Vero细胞中进行表达并测定其免疫效果。将18只BALB/c小鼠（雌雄各半）随机分为3组（PVAX1-ENO质粒DNA免疫组、PVAX1空载体对照组及PBS对照组）,每组6只,每组小鼠对应免疫接种PVAX1-ENO质粒DNA、PVAX1空质粒和PBS。分离血清并通过ELISA方法测定血清中ENO蛋白抗体效价、IgG₁和IgG_2a抗体水平及IFN-γ和IL-4细胞因子水平。三免2周后每组选取3只小鼠检测CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,本试验成功构建了PVAX1-ENO质粒DNA,经PCR和酶切鉴定正确,并能在Vero细胞中成功表达。PVAX1-ENO质粒DNA免疫组ENO蛋白抗体水平、IgG₁和IgG_2a抗体水平、IFN-γ和IL-4细胞因子水平及CD4⁺和CD8⁺含量均显著高于PVAX1空载体对照组及PBS对照组（P<0.05）。结果表明,PVAX1-ENO质粒DNA可显著提高BALB/c小鼠的体液免疫水平,并在一定程度上刺激BALB/c小鼠细胞免疫。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR~259中,构建PCR~259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR~259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR~259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO构建成功。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验(IFTA)鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组:重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4~+和CD8~+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10~9 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及表达质粒的构建

根据GenBank上发表的猪附红细胞体全基因组序列(登录号:NC_015153.1),针对其中的信号识别颗粒(SRP)基因设计合成一对特异性引物,应用PCR方法扩增猪附红细胞体信号识别颗粒54 (SRP54)基因片段,克隆至pMD18-T simple载体上,经PCR、酶切初步鉴定正确后进行测序,对所克隆片段进行生物信...     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白（命名为rMseno）对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。     

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白(命名为rMseno)对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。     

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10¹⁰ pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG₁、IgG_2a和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对...     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素（ubiquitin，Ub）基因与密码子优化的PRRSVGP5蛋白（optiGP5）基因融合表达质粒pIR—Ub—optiGP5。间接免疫荧光和Western—blot分析表明，重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR—optiGP5和pIR—Ub—optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB／c小鼠后，分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示，pIR—optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体，而pIR—Ub—optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体，但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR—optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

猪附红细胞体MSG1部分基因片段的全基因合成及克隆表达

通过人工合成猪附红细胞体MSG1基因的编码序列,以提高目的基因在大肠杆菌中的高效表达。根据Gen-Bank注册的AM407404的544～942氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了12条寡核苷酸片段。用重叠区扩增法(PAS)全基因合成MSG1部分目的基因,克隆入pjet1.2/blunt载体。经测序证实正确后,构建原核表达载体pET-28c/MSG1,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,获得含重组表达质粒的转化子,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。测序、酶切鉴定等结果表明,表达载体构建成功,诱导表达后大约在16000的位置出现明显的蛋白条带。     

猪附红细胞体的诊治

猪附红细胞体(又名红细胞胞子虫),寄生于血液中,附于红细胞表面或细胞里。是猪的一种热性、溶血性、散发为主的传染病。病原能使红细胞变性、红细胞变形、破坏,从而导致猪自身免疫溶血性贫血,血液凝固障碍,而引起出血、低血糖和酸中毒以及机体免疫抑制。     

猪附红细胞体的防治

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体虫寄生于红细胞内或血浆中而引起的一种人畜共患的热性、溶血性传染病。猪只感染后可引起大批死亡。该病自1972年在我国江苏发现后,每年各地均有发病的报     

猪附红细胞体的防治

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体虫寄生于红细胞内或血浆中而引起的一种人畜共患的热性、溶血性传染病.猪只感染后可引起大批死亡.该病自1972年在我国江苏发现后,每年各地均有发病的报道.     

表达柔嫩艾美耳球虫HMGB1基因质粒DNA的免疫效果分析

旨在评价表达柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)HMGB1基因质粒DNA免疫对同源株攻虫的免疫保护效果。将EtHMGB1基因插入pcDNA3.1(-)/myc-His A真核表达载体中,并在Hela细胞中进行体外瞬时表达。设计了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1免疫组、pcDNA3.1(-)/myc-His A免疫组、重组蛋白质+FCA佐剂免疫组、pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1+重组蛋白质联合免疫组、FCA佐剂免疫组、未免疫攻虫组和未免疫未攻虫组7个试验组。分别于14和21日龄对鸡进行两次免疫,28日龄时除未免疫未攻虫组外各组用1×104个E.tenella孢子化卵囊攻虫,以平均增重、卵囊产量和病变记分作为免疫保护效果的评价指标。结果显示,成功构建了pcDNA3.1(-)/myc-EtHMGB1重组质粒,转染后该质粒可在Hela细胞中进行瞬时表达。该重组质粒单独免疫、重组蛋白质单独免疫或重组质粒与重组蛋白质联合免疫均对鸡肠道病变改善效果不明显,但可显著提高增重,降低卵囊产量,尤以重组质粒与重组蛋白质联合免疫效果最佳,显示Prime-boost免疫策略可提高该重组质粒的免疫保护效果。上述结果显示HMGB1可作为未来球虫疫苗研制的良好候选抗原之一。     

猪附红细胞体MSG1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸.同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5％～98.3％,氨基酸的相似性为97.9％～99.1％0.MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远.     

长效土霉素治疗猪附红细胞体效果好

(一)发病情况 山东省龙口市东江镇一养猪场共饲养育成猪186头,一天发现有15头猪精神沉郁,食欲不振,体温升高,用青、链霉素、安乃近注射,不见好转,三天后该猪场又有50余头猪发病.此时,病猪消瘦,体温持续高热,最高可达42℃,症状也渐渐明显,可见皮肤与粘膜苍白,有时黄疸,四肢特别是耳廓边缘为紫绀色,指压不褪色.     

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定

通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。