蓝狐MITF-M基因序列扩增及生物信息学分析

试验旨在研究蓝狐MITF-M基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据。从成年蓝狐背部皮肤组织中采集1 cm×1 cm样品,采用RT-PCR扩增及测序技术首次获得MITF-M基因序列3 880 bp（包括5'侧翼区2 262 bp、CDS区1 260 bp、3'侧翼区358 bp）,编码419个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示,蓝狐MITF-M基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域（-86~-336 bp）,且发现TATA框、CAAT框、GC框和CRE等调控元件及CREB、LSF和Sp1等多种转录因子。MITF-M基因编码的蛋白是定位于细胞核和细胞质的不稳定、可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位结果提示该蛋白在细胞核、细胞质和线粒体的概率较高,分别为65.2%、17.4%和8.7%。DNAMAN软件对MITF-M基因编码蛋白的二级结构预测发现,该蛋白由α螺旋（33.66%）、β折叠（16.66%）和无规卷曲（49.68%）组成,且不存在跨膜区域和信号肽。蓝狐与其他物种MITF-M基因编码的氨基酸序列同源性对比和系统进化树分析均提示蓝狐与犬的遗传亲缘关系最近,与哺乳动物和禽类均具有较高的同源性（>89.1%）,说明MITF-M基因编码区在物种进化过程中较为保守。本研究为深入研究MITF-M基因调控狐狸被毛颜色的分子遗传机制奠定了理论基础。     

北极狐CBD103基因序列生物信息学分析及启动子预测

为了研究北极狐CBD103基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、CBD103基因编码蛋白结构及功能,同时探究该基因的表达调控机制,试验通过RT-PCR扩增及测序技术从北极狐皮肤组织中获得CBD103基因cDNA序列,并利用生物信息学方法对所得序列进行预测分析。结果表明:获得序列全长2 327 bp(包括5'侧翼区2 071 bp、CDs区204 bp、3'侧翼区52 bp),编码67个氨基酸残基。北极狐CBD103基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域和CpG岛,且发现GC框、TATA框、CAAT框等调控元件及Sp1、Ets、Mef-2、ERE、Myc等多种转录因子。CBD103基因编码的蛋白是定位于细胞核和线粒体的不稳定疏水性蛋白质,此蛋白无规卷曲所占比例较大,使得蛋白构象多样化,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近。说明CBD103基因在不同物种间具有一定的保守性,且各物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,同时符合动物分类学。     

北极狐酪氨酸酶基因cDNA序列分析及启动子预测

为了探明北极狐酪氨酸酶(tyrosine,TYR)基因核心启动子活性区、转录因子结合位点、基因编码蛋白结构及功能,通过RT-PCR扩增及基因测序技术首次从北极狐皮肤组织中获得TYR基因c DNA序列,全长4 300 bp(包括5'侧翼区2 681 bp,CDS区1 593 bp,3'侧翼区26 bp)。生物信息学分析结果表明:北极狐TYR基因5'侧翼区存在潜在的启动子区域,并发现TATA框和CAAT框等调控元件及髓细胞增生原癌基因(Myc)、胰十二指肠同源盒1(Pdx1)、V-Myb髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(Myb)、E26转录因子1(Ets1)、特异性蛋白1(Sp1)和TATA盒结合蛋白(TBP)等多种转录因子。北极狐TYR基因编码蛋白的长度为530个氨基酸残基,编码蛋白是定位于生物膜上的不稳定可溶性亲水蛋白质,该蛋白以无规卷曲为主,主要参与信号转导和转录,存在跨膜区域和信号肽。北极狐与其他物种的系统进化树分析提示北极狐与家犬的遗传亲缘关系最近,不同物种间亲缘关系与生物进化观点基本一致,符合动物学分类。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

豪猪MITF-M转录本测序及其生物信息学分析

为获得豪猪MITF-M转录本序列,并对其进行生物信息学分析,试验首先将人工饲养豪猪的耳廓皮肤组织样本提取总RNA后进行无参转录组测序,对获得的所有MITF转录本通过序列比对分析筛选豪猪MITF-M转录本序列,然后采用生物信息学在线软件对豪猪MITF-M基因编码蛋白的理化性质、氨基酸组成、亚细胞定位、二级结构、三级结构、信号肽和跨膜区域进行预测和分析,最后分析豪猪与大鼠、鸡、绵羊等9个物种MITF-M蛋白的同源性,并采用邻接法构建MITF-M蛋白的系统进化树。结果表明：获得豪猪MITF-M转录本序列(已上传至GenBank,登录号为MW84037),序列全长为4 772 bp,含9个外显子,CDS长度为1 260 bp(229～1 488 bp),编码419个氨基酸。豪猪MITF-M蛋白化学分子式为C₂₀₁₀H₃₂₆₃N₅₈₅O₆₅₂S₂₆,共由6 536个原子组成;相对分子质量为46 890.11;理论等电点为5.82,为酸性蛋白质;脂肪氨基酸系数为79.64,不稳定指数为69...     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

家蚕泛素结合酶新基因的克隆与基因组结构及5′调控区分析

在家蚕丝腺cDNA文库测序过程中,发现一个编码家蚕泛素结合酶的EST序列,利用3′RACE方法克隆了一个新的家蚕泛素结合酶基因cDNA全长序列,命名为BmUCE2 I(GenBank登录号为DQ219874)。家蚕BmUCE2 I基因全长cDNA由465 bp的开放阅读框序列(ORF)、97 bp的5′端非翻译区序列(5-′UTR)和237 bp的3′端非编码区序列(3-′UTR)组成,其编码的154个氨基酸与其他真核生物间具有较高的同源性。利用BmUCE2 I的EST片断作探针,通过筛选家蚕噬菌体基因组文库,获得了家蚕BmUCE2 I基因组序列和5′调控序列。BmUCE2 I基因由4个外显子和3个内含子组成,在5′端上游调控区域没有类似TATA盒元件,但在-219~-268 bp的区域存在一个50bp的启动子序列,此外还存在CF2-Ⅱ、FTZ、DFD、BRCZ2、DL、STAT、PRD-HD等多个转录因子结合位点。家蚕泛素结合酶新基因的克隆、基因结构及5′调控区的分析为进一步研究泛素蛋白水解酶复合通路相关基因的调控规律提供了重要依据。     

鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列生物信息学分析

为解析鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列的结构特征及其转录调控机制，本研究基于NCBI数据库中鸡EDN3基因5′侧翼区与外显子1共计2 052 bp核苷酸序列，利用不同在线软件对其核心启动子区域、顺式作用元件、转录因子结合位点及CpG岛等结构进行生物信息学预测分析，并通过DNASTAR Lasergene 17.3和MEGA 5.0软件进行不同物种EDN3基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建。结果表明：鸡EDN3基因起始密码子上游592～2 000 bp为可能的候选核心启动子区；5′侧翼区633 bp和1 547 bp存在2个潜在的转录起始位点T和A;该基因启动子区存在2个CAAT-box、3个GC-box、6个TATA-box、9个E-box和3个CpG岛结构域。综合多种在线软件预测，鸡EDN3基因启动子区存在Sp1、C/EBPα和NF-1等转录因子结合位点。鸡EDN3基因启动子区序列与环颈雉、鹌鹑、岩雷鸟、棕硬尾鸭、凤头潜鸭、山羊、绵羊、牛、猪和人的相似性为38.8%～90.3%;系统进化树表明，鸡与鹌鹑亲缘关系最近，与猪亲缘关系最远。研究结果为进一步探明鸡色素沉积关联E...     

贵州白山羊MyoG基因启动子区序列克隆及生物信息学分析

【目的】本研究旨在解析肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列的结构特性及其转录调控机制。【方法】以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,设计2对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术获得MyoG基因启动子区序列,通过DNAStar和Mega 5.0软件分别进行不同物种MyoG基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学软件预测分析该序列核心启动子区、转录因子结合位点、顺式作用元件、CpG岛等结构特征。【结果】贵州白山羊MyoG基因启动子区序列长2 334 bp,包括2 092 bp的5′-侧翼序列和242 bp的外显子1,GC含量略低于AT含量。通过不同物种比对分析,贵州白山羊MyoG基因启动子区序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和鸡同源序列相似性分别为98.34%、96.15%、77.76%、74.15%、57.63%和43.04%。系统进化树结果表明,贵州白山羊与绵羊和牛的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学结构预测发现,贵州白山羊MyoG基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游50 bp, 5′-侧翼区存在1个潜在的启动子区域和1个CpG岛,含有1个TATA...     

赤狐EDNRB基因编码区序列分析及启动子预测

为了研究赤狐内皮素受体B基因(EDNRB)编码蛋白的结构、功能及预测其5′端上游2 000 bp的候选启动子区的核心启动子区与转录因子的结合位点,从NCBI数据库中获得赤狐EDNRB基因的数据,利用生物信息学方法分析其编码区及候选启动子区。结果表明:赤狐EDNRB基因编码氨基酸的总数为443个,编码产物为不稳定的疏水蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,存在信号肽和二硫键。该编码蛋白存在于内质网、细胞质膜和线粒体中。该编码蛋白含有7次跨膜G蛋白偶联受体超家族结构域。赤狐与乌苏里貉的亲缘关系最近,与犬关系较近。该基因的5′端上游存在潜在的启动子区域,同时发现存在转录调控元件和转录因子结合位点,不存在CpG岛。通过对赤狐EDNRB基因进行生物信息学分析,能够初步预测其编码区的结构、功能以及该基因的核心启动子区与转录因子结合位点,为其遗传特性及调控机制的研究提供基本信息。     

一个新的家蚕锌指蛋白基因的克隆及基因组结构分析

锌指蛋白是一类能与细胞内核酸特异结合 ,调控基因表达活性 ,对细胞分裂、分化、胚胎发育及个体生长有重要作用的转录因子。从家蚕 5龄丝腺组织cDNA文库中克隆了一个具有锌指结构的新基因 ,命名为BmZFP基因 (GenBank登录号 :AY75 36 5 9) ,其cDNA全长为 180 9bp ,编码 14 3个氨基酸 ,3′端非翻译区 (3′ untranslatedregion ;3′ UTR)达 1332bp碱基序列。BmZFP氨基酸序列推测有 6个功能结构域 ,是一种CCHC型锌指蛋白。虽然BmZFP氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白的氨基酸序列同源性只有 33%左右 ,但 6个功能域中的Cys(C)和His(H)却完全匹配 ,推测其功能与人、大鼠和小鼠的相关锌指蛋白有相似性。BmZFP基因序列的结构分析表明 :该基因由 2个外显子和 1个 14 86bp碱基序列的内含子组成 ,在 5′端上游 - 182～ - 2 2 2区域存在一个启动子元件 ,但不是典型的TATA盒启动子。     

蓝狐与银狐褪黑激素受体1A基因的克隆及序列分析

根据其它物种褪黑激素受体（melatonin receptor, MTNR）1A基因核酸序列的同源性设计引物,PCR扩增蓝狐和银狐MTNR1A基因的546 bp DNA序列,GenBank登录号分别为EU170442和EU170443。蓝狐和银狐MTNR1A基因DNA序列同源性为99.1%,编码的氨基酸同源性为99.4%,与人、鼠及绵羊MTNR1A基因同源性为84%~86%,与鸡MTNR1A基因同源性为74%。     

桑树光合系统Ⅰ psaE基因的克隆及表达分析

利用桑树(MorusL.)表达序列标签(EST),采用RT-PCR方法克隆了桑树光合系统Ⅰ(PSⅠ)psaE基因的全长cDNA序列,命名为MpsaE(GenBank登录号:GU645972)。序列分析表明,该基因序列全长705bp,存在97bp的5′端非翻译区和170bp的3′端非翻译区,其开放阅读框(ORF)长438bp,编码含有146个氨基酸的蛋白,预测蛋白分子质量为15.38kD,等电点为8.08。同源性分析表明,MpsaE编码蛋白与柑桔(Citrus sinensis)、毛果杨甙(Populus trichocarpa)和欧美杨(Populus eu-ramericana)psaE基因编码的蛋白具有较高的同源性,相似性达到98%。基于MpsaE与其它18个物种的psaE基因编码氨基酸序列构建的系统进化树显示,桑树与柑桔、蓖麻(Ricinus)、毛果杨甙和欧美杨的亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MpsaE基因mRNA在桑树不同组织及部位的转录水平有明显差异:在叶片中的转录水平较高,其中幼叶(刚展开的第1片叶)和中部叶片(8-10位叶)的转录水平最高,其次为上部叶片(2-3位叶)、顶芽和下部叶片;在根部的转录水平最低。初步推测MpsaE基因是桑树PSⅠ参与某些光合生理反应的一个亚基。     

猪Nrf2基因克隆、生物信息学分析及启动子区转录活性分析

旨在了解猪Nrf2基因的结构和功能,研究Nrf2基因的转录调控机制。本研究选取6头90 kg左右的健康大蒲莲猪为试验动物,采用cDNA末端快速克隆技术(RACE)和染色体步移技术获得大蒲莲猪Nrf2基因完整的cDNA序列和启动子区域,利用生物信息学软件分析Nrf2基因及其启动子区域的生物学特征。结果,Nrf2基因cDNA全长2 358 bp,包括87 bp的5′UTR,495 bp的3′UTR序列,CDS区大小为1 776 bp,编码591个氨基酸。对预测蛋白质序列进行生物信息学分析,蛋白分子量为66.402 7 ku,理论等电点(pI)为4.66,大部分二级结构为α-螺旋。采用染色体步移技术扩增得到5′侧翼序列2 091 bp的片段。Nrf2基因5′侧翼区经预测含有典型的TATA-box,不含CpG岛。构建不同长度启动子片段的pGL3-Basic表达载体,转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测,提示在-903～-710 bp区域内可能存在正调控区或增强子,生物信息学预测其中含有多个转录因子结合位点,可能参与Nrf2基因转录调控。本研究成功获得了Nrf2基因完整的cDNA序列和启动子区域,并且发现-903～-710 bp为核心启动子,本研究为猪抗氧化应激的遗传改良提供一定理论基础。     

山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。