.基于TaqMan探针的牛布氏杆菌实时荧光定量PCR的特异性鉴定

根据牛布氏杆菌BM28保守序列设计引物和探针,建立了一种快速鉴定牛布氏杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示:5.0×105~5.0×101拷贝范围内定量PCR均有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为50拷贝每微升。本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性和重复性好、方便经济的特性,在牛布氏杆菌的检测与鉴定中具有良好的应用前景。     

快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10^-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好(t=1.178,P=0.332)。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。     

化脓隐秘杆菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本试验旨在建立检测化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes,A.pyogenes)特异、灵敏的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据GenBank公布的化脓隐秘杆菌溶血素(pyolysin,PLO)基因高保守序列,设计特异性引物和探针建立检测体系,用于化脓隐秘杆菌的快速检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行检测。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法仅对化脓隐秘杆菌的检测结果为阳性;该方法最低检测DNA浓度为77.6 fg,最低检测细菌浓度为63 CFU/mL。采用本研究建立的方法检测23份林麝临床病例样品,共鉴定出16株化脓隐秘杆菌,与API Coryne生化鉴定方法的结果相同。本研究为化脓隐秘杆菌的检测提供了一种灵敏、特异、快速的检测方法,其可用于化脓隐秘杆菌的诊断和流行病学调查。     

布氏杆菌微滴数字PCR方法的建立

为建立一种布氏杆菌微滴数字PCR qPCR方法,对布氏杆菌病的定量诊断提供技术支持,在实时荧光PCR (qPCR)检测方法(T/CVMA 20-2020)的基础上,建立了布氏杆菌微滴数字PCR方法,并对方法的反应条件进行了优化,同时对其敏感性、特异性、重复性进行了评估.结果 显示:本方法的最低检测下限为2.6 copi...     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

犬圆环病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

建立了犬圆环病毒(canine circovirus, CanineCV)EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法。用PCR方法克隆CanineCV Rep基因中的高保守区,扩增的目的片段大小为217 bp,将其克隆至pMD18-T载体上,构建PCR检测阳性参考质粒,并用阳性参考质粒,进行各项反应条件优化。建立的标准曲线呈现出较高拟合性的线性回归,R²值为0.999 5;该方法检测灵敏度为3.88×10¹ copies/μL;在重复性试验中,组内和组间重复变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的重复性;该方法对犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬流感病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型、犬冠状病毒等犬常见病原的检测均无交叉反应;临床样本检测表明,所建立的EvaGreen实时荧光定量PCR对CanineCV的阳性检出率为2.82%(5/177),高于普通PCR检测的CanineCV阳性率1.13%(2/177)。本研究成功建立了一种用于快速检测CanineCV的EvaGreen qPCR方法,该方法安全且具有较好的特异性、敏感性和重复性,可作为Canine...     

羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

山羊痘和绵羊痘是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。为了更快、更准确的诊断该病,本研究根据Gen Bank已经发表的GTPV和SPPV参考毒株(登录号分别为AY077836和AY077832)A29L基因序列,设计合成了1对特异性引物和2条Taq Man探针,同时制备重组质粒标准品。经过反应条件的优化,建立了羊痘病毒实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的实时荧光定量PCR方法反应体系的特异性、灵敏性和重复性进行了评价,并用此方法对19份临床样品进行了检测。结果显示:该诊断方法与4种非羊痘病毒不发生交叉反应,并且山羊痘病毒和绵羊痘病毒之间也不发生交叉反应。该方法的重复性试验变异系数均低于2%,并且双重实时荧光定量PCR最低浓度检测限分别为470和440 fg。对标准阳性模板进行定量检测,生成的标准曲线相关系数分别为0.995和0.997。在检测的临床样品中,GTPV和SPPV阳性分别有14和4份,混合感染有1份。结果表明所建立的方法具有良好的特异性,灵敏性、稳定性,可以对GTPV和SPPV进行准确的定量检测。     

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速、敏感、特异的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCR)检测方法,根据Gen Bank登录的HPS 16S rRNA基因序列,设计1对特异性引物和1条特异性Taq Man-MGB探针,建立了HPS荧光定量PCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性以及重复性和稳定性进行了验证。结果显示:本研究建立的HPS FQ-PCR方法在10~1~10~6拷贝/μL模板范围内有很好的线性关系,所得相关系数为0.998;检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;特异性好,对pGEM-T/HPS重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对4个对照病原的扩增曲线均呈现阴性反应;对不同浓度的pGEM-T/HPS重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好。对30份临床疑似HPS感染的组织样品进行应用检测,检出19份阳性,比商品化的HPS FQ-PCR检测试剂盒及常规PCR方法的阳性检出率高。结果表明,本研究建立的HPS FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的优点,可用于临床HPS感染猪的早期检测,对HPS的快速诊断、综合防控具有重要意义。     

牛副结核分枝杆菌实时荧光定量 PCR 检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛副结核分枝杆菌C-2染色体的ISMav2基因保守区域序列设计合成1对特异性引物,建立了一套SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测牛副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)的方法。以实验室构建的牛副结核分枝杆菌pMD-ISMav2阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,其相关系数为0.999。以构建的标准品为模板,进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法检测布氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌DNA均为阴性;最低可检测到相当于每微升1.96×10¹拷贝数的标准品阳性质粒。本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感和快速等优点,可用于牛副结核杆菌病的监测。     

志贺氏菌检测和分群实时荧光PCR方法的建立

为对志贺氏菌属细菌进行快速、准确检测和分群鉴定,根据志贺氏菌invC、rfc、wbgZ和rfpB基因,分别设计引物和探针,建立了鉴定志贺氏菌属以及福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺菌氏菌实时荧光PCR方法,同时将根据ompA基因设计的引物和探针作为内参照,并通过特异性试验和人工接种试验等对该方法进行验证。结果显示,该方法对17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌均出现100%的特异性;用增菌肉汤直接进行PCR检测,发现在消毒奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、熟肉和香肠等即食食品中的志贺氏菌检出限为1～3 cfu/25 g(mL),在原奶、生肉和奶粉中的检出限分别为≤8 cfu/25 mL、12 cfu/25 g和≤12 cfu/25 g;分离培养后再对可疑菌落进行实时荧光PCR鉴定,发现所有样品的检出限为1～3 cfu/25 g(mL),与传统培养法检出限一致。结果表明,该实时荧光PCR方法是一个快速、敏感、特异的检测方法,适合于志贺氏菌的常规检测分析。     

布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体双重PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法,本研究据GenBank上已发表的具有属间特异性的布鲁氏菌bp26基因和鹦鹉热衣原体23S rRNA基因,利用 Primer Premier 5.0软件各设计1对特异性引物,扩增的目的片段长度分别为219和356 bp。通过优化反应条件,建立了能同时检测布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体的双重PCR方法。该方法具有较好的特异性和可重复性,对2种基因单重PCR检测敏感性均达到3.1×10²拷贝/反应,双重检测的灵敏度为3.1×10³拷贝/反应。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液共172份临床疑似布鲁氏菌感染的样品进行检测,检测到布鲁氏菌阳性样品53份,鹦鹉热衣原体阳性样品2份,以上这2种病原的阳性检出率分别为30.8%和1.2%,且检测到2种病原混合感染的阳性样品2份,阳性检出率为1.2%。临床应用结果表明,该方法可用来对布鲁氏菌和鹦鹉热衣原体进行同步、快速、灵敏的检测。     

牛诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛诺如病毒（BNoV）是国内新发的犊牛腹泻病原,笔者拟建立检测BNoV的Real-time PCR方法。根据BNoV流行株的RNA聚合酶（RdRp）基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BNoV的Real-time PCR方法。该检测方法的Ct值与标准品模板在2.24×10²~2.24×10⁸拷贝·μL^-1线性关系良好,相关系数R²=0.997,扩增效率为98.44%;该方法可特异性检出BNoV,对其他犊牛腹泻相关病原呈阴性;最低检测限为22.4拷贝·μL^-1;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月-2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本中BNoV的检出率为11.31%（25/221）,采样场阳性率为92.86%（13/14）。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BNoV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒并且能够区分普通毒株和高致病性毒株的荧光PCR方法,根据GenBank已经公布的国内发表的高致病性PRRSV NSP2基因序列,针对Nsp2缺失区设计一对引物和探针,在结合PRRSV通用检测引物探针进行荧光定量PCR,对反应条件进行优化,用已知PRRSV普通株和高致病性株及其他病毒进行试验.结果表明,该方法可以特异检测并区分高致病性株和普通株.将该方法用于临床标本的检测,通过对32份样本检测,通用阳性为28份,阳性率为87.5％.高致病性株为17份,阳性率为59.38％.表明建立的方法可以用于PRRSV的快速检测,并且可以区分普通株和高致病性株.     

鸭副黏病毒和鸭圆环病毒二重荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸭副黏病毒(DPMV)和鸭圆环病毒(DuCV)保守基因序列,设计了2对针对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的特异性引物和2条不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的二重荧光定量PCR检测方法。该方法敏感性好,对鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性分别达到160和140个拷贝数;该方法特异性强,对鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭瘟病毒和H9型禽流感病毒等病原体的检测全为阴性;应用该方法对118份临床病料进行检测,结果检出鸭副黏病毒和鸭圆环病毒阳性感染率分别为0.85%和8.47%,无混合感染。本试验建立的二重荧光定量PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,适用于鸭副黏病毒和鸭圆环病毒的快速诊断和监测。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。     

牛布氏杆菌PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的牛布氏杆菌外膜蛋白OMP31的基因序列设计特异性引物,对牛布氏杆菌样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增的目的片段大小为602 bp,与预期扩增序列同源性为99.7％;该PCR检测体系的特异性强,不能在非布氏杆菌 DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.9 pg/μL。该检测体系的成功构建为牛布氏杆菌病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

鉴别牛结节性皮肤病病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为实现牛结节性皮肤病病毒（LSDV）和羊痘病毒属（CaPV）其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及Taq Man探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和CaPV其他成员的双重荧光定量PCR检测方法。结果显示：本方法可以特异性扩增LSDV和CaPV其他成员,并且与其他牛、羊病毒无交叉反应,特异性好;对pLSDV-010和pCaPV-068质粒标准品的最低检测限均为15 copies/μL,具有较高的灵敏性;组内和组间变异系数均小于1.75%,重复性良好。应用本试验建立的方法与荧光定量PCR方法同时检测542份临床样品,发现CaPV的样品符合率为98.52%,LSDV为99.63%。本试验建立的方法为CaPV鉴别筛查、LSDV精准防控及流行病学调查提供了快捷有效的技术手段。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究针对猪伪狂犬病病毒的gE基因序列进行分析比较,设计了一条TaqMan-MGB探针,建立了区别野毒株及基因缺失疫苗株的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法检测猪伪狂犬病病毒特异性强,能很好的区分猪伪狂犬病病毒与其它病毒。用该方法对83份疑似样本进行检测,与常规PCR检测法符合率达到100%,表明该方法用于检测猪伪狂犬病病毒具有良好的实用性。