果蝇免疫基因的激活

果蝇免疫基因的激活周永富饶军华阳建春（广东省昆虫研究所广州５１０２６０）１．引言受经典脊椎动物免疫学研究模式的影响，长期以来，昆虫免疫机制的研究主要集中在昆虫免疫球蛋白及昆虫免疫记忆方面。１９７４年Ｂｏｍａｎ等从鳞翅目昆虫天蚕（Ｈｙ－ｌａｏｐｈｏｒａ...     

昆虫与弹状病毒互作的研究进展

近年来宏基因组学研究的普及大大丰富了人们对RNA病毒多样性的认识,但对这些新发现病毒的生物学特性却所知甚少。本文围绕RNA病毒中一类重要的负单链RNA病毒--弹状病毒与其昆虫寄主互作的研究进行综述,总结已发现的弹状病毒及其昆虫寄主类型,共有20个属144种弹状病毒可以感染14个属的昆虫;根据已有的系统进化研究对弹状病毒的寄主起源进行推测;并以感染黑腹果蝇Drosophila melanogaster的sigma病毒(Drosophila melanogaster sigma virus,DMelSV)为主要对象,就弹状病毒引起的CO2麻痹致死症状以及昆虫寄主对其的免疫反应研究进行总结,而在对黑腹果蝇的研究中发现很多非经典免疫通路中的新抗病毒基因,暗示存在新的抗病毒免疫通路;通过飞虱、叶蝉与其传播的植物弹状病毒以及长须罗蛉Lutzomyia longipalpis与其传播的脊椎动物病毒的互作研究,发现Toll、IMD信号通路、细胞自噬及小RNA干扰(small interfering RNA,siRNA)通路等可能与昆虫对弹状病毒的免疫反应相关。昆虫是弹状病毒主要的寄主和媒介,也是病毒遗传多样性的储主,因此更好地研究和了解昆虫寄主与弹状病毒的相互关系,有助于病毒致病和传播机制以及昆虫抗病毒免疫机理的深入研究。     

异色瓢虫乳酸脱氢酶基因的克隆与序列分析

乳酸脱氢酶（1acticdehydrogenase,LDH）是糖酵解途径的终止酶,在整个昆虫的发育阶段长期存在。本试验采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmoniaaxyridis中克隆到HaxLDH基因的cDNA全序列（GenBank登录号HM362898）,全长1336bp,包含214bp的3’非编码区域和123bp的5,非编码区域,可读框长999bp,编码332个氨基酸。通过软件分析,预测该基因编码蛋白的分子量为36．2kD,理论等电点为8．62;包含1个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。同源比对不同昆虫的LDH基因cDNA序列,发现HaxLDH拥有8个非常保守的结构域：DLQHG、TAGV／ARQK／RE／DGES／TRL、LVQRN、GSGTNLD、SCHGW／YI／VI／VGEHGD、VWSG／AVNV／IAGV、AYEV／IIK／RLKGYTS／NWAI／VGLS和LSLP。HaxLDH与赤拟谷盗Triboliumcastaneum的LDH同源性最高,达67％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近。本研究为探讨LDH在昆虫发育和逆境中的作用奠定了基础。     

美国的两种植物保护新装置

１新式果蝇诱饵与捕集器佛罗里达州迈阿密的农业研究中心科学家RobertHeath发明了１种果蝇诱饵与捕集器。该捕集器组合农药和可视刺激源，可更有效地诱捕果蝇。捕集器的一个柱状部分用来模拟三维果实，为果蝇提供可视刺激源。捕集器的化学物质刺激源从３种物质中获得：氨、腐烂物和三甲胺，而不需要食物诱饵。化学物质引诱雌雄果蝇进入捕集器，位于捕集器顶部和底部的光亮盘使果蝇本能地向光运动，果蝇被滞留在里面，并被引诱到包含可食刺激源和致命含糖毒药的盘内。２新型昆虫检测装置迈阿密农业研究中心的科学家们合作开发了１种易于使用…     

格氏线虫表皮蛋白和分泌蛋白抑制昆虫免疫活性的比较

格氏线虫表皮蛋白和分泌蛋白都具有抑制昆虫免疫反应的能力,能够帮助侵染期线虫侵染寄主,但两者所含蛋白组分并不相同,从而导致蛋白活性也有所差异。本研究采用乙醇萃取和昆虫匀浆诱导,分别从侵染期的格氏线虫体表及分泌物中得到了表皮蛋白和分泌蛋白,并比较了这两者之间的异同。结果表明,无论是在昆虫体内还是体外,侵染期线虫表皮蛋白和分泌蛋白都具有抑制昆虫免疫反应的生物活性,并且分泌蛋白的活性更强。本研究为进一步研究线虫侵染与昆虫免疫间的相互关系和线虫抑制昆虫免疫反应的作用机理提供了科学佐证。     

昆虫病毒在害虫防治上的应用及其对寄生蜂的影响

本文综述了昆虫病毒，包括核多角体病毒（NPV）、昆虫痘病毒（EPV）和颗粒体病毒（GV），在防治农林害虫中的应用及其对寄主寄生蜂影响的研究进展，同时也介绍了昆虫杆状病毒诱导细胞凋亡及基因工程研究的近况。     

小卷蛾线虫对家蝇幼虫的室内侵染试验

用昆虫病原线虫防治双翅目昆虫如蘑菇蝇（Ｌｙｃｏｒｉｅｌａａｕｒｉｐｉｌａ）、地中海果蝇（Ｃｅｒａｔｉｔｉｓｃａｐｉａｔａｔ）、甘兰种蝇（Ｄｅｌｉａｒａｄｉｃｕｍ）、韭菜蛆（Ｂｒａｄｙｓｉａｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）等国内外均有报道，说明线虫防治双翅目害虫...     

昆虫免疫及五种重要入侵昆虫免疫机制研究进展

我国入侵昆虫种类繁多、为害范围广,在植物检疫与入侵生物学领域备受关注。昆虫免疫是指昆虫识别"自己"和"异己"成分、破坏或排斥外来有害物质,从而维持自身健康并延长寿命的反应机制,在入侵昆虫的传入、定殖和为害过程中发挥着重要作用。本文综述了模式昆虫黑腹果蝇Drosophila melanogaster的免疫机制,并在此基础上分析了5种代表性入侵昆虫红棕象甲Rhynchophorus ferrugineus(Oliver)、烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)、意大利蜜蜂Apis mellifera lingustica Spinola、日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus Green和舞毒蛾Lymantria dispar(L.)的免疫机制以及该机制在其生物入侵过程中发挥的作用,提出了加强重要入侵昆虫免疫机制研究的展望,一方面要加强研究更多种入侵昆虫的免疫机制,另一方面应将关注点逐步从免疫现象的发现深入至分子机制。     

小西葫芦黄花叶病毒北京分离物的鉴定及其基因组3''端特性分析

在北京东郊自然感病的南瓜Cucurbita moschata上获得一病毒分离物（BJ-1），经生物学、血清学和分子生物学鉴定，确定为小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）。为分析其基因组3’端特性，以发病叶片中提取的总RNA为模板，对基因组3’端进行RT-PCR扩增，产物克隆到pMD18-T栽体上进行序列分析，共测定了该病毒分离物包括全部CP基因在内的1269bp。该分离物CP基因由837个核苷酸组成，编码279个氨基酸。对包括该分离物在内的30个序列的760bp（含NIb基因3’端56bp和CP基因中的704bp）片段、NIb蛋白与CP蛋白的切割位点、蚜传必需基序的变异、寄主来源及地域来源进行了分析。结果表明，ZYMV不同分离物的基因分型与上述五个因素无明显关系。     

褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domainserineprotease,CSP）是广泛存在于昆虫体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类,在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定获得一个褐飞虱CSP编码基因NlCSP4(GenBank登录号：OK018340）,其cDNA序列全长1911bp,编码636个氨基酸,预测蛋白质分子量为69.29kD,等电点为9.02。NlCSP4蛋白N端包含一段由25个氨基酸残基组成的信号肽和一段由44个氨基酸残基组成的clip结构域,C端具有CSP蛋白家族典型的Tryp＿SPc结构域,且其中包含特异性保守的His-Asp-Ser催化中心三元件。系统发育分析表明NlCSP4与其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ进化树上聚为一支,而与鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,NlCSP4基因表达具有明显的时空特异性,其在雌成虫中的表达量最高,且高龄若虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄若虫期;NlCSP4基因在褐飞虱雌成虫脂肪体、肠道和卵巢中均有表达,且在脂肪体中表达量最高;金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）...     

转基因康乃馨两种类黄酮-3',5'-羟化酶基因检测方法的建立

康乃馨（Dianthus caryophyllus L.）是全球贸易量最大的鲜切花之一。转基因康乃馨因颜色新奇、花型丰富、插瓶期长等特点深受消费者喜爱。现有19个转基因康乃馨品系列入全球商业化种植，其中18个品系因转入了类黄酮-3’,5’-羟化酶（flavonoid-3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因而产生了蓝紫色花瓣的性状。18个品系转入的F3’5’H基因中11个来源于大花三色堇（bp40基因），还有7个来源于矮牵牛（hf1基因）。我国目前没有批准转基因康乃馨进口，更缺乏相关检测方法。建立转基因康乃馨外源基因筛查方法，用以防范转基因康乃馨种苗、鲜切花等非法进入我国显得至关重要。本研究针对转基因康乃馨中最常见的两种不同来源F3’5’H基因，建立了普通PCR和实时荧光PCR检测方法，构建了适于两个基因检测的质粒分子，并将这两种方法应用于进境产品检测。结果表明，建立的bp40基因和hf1基因检测方法均具有特异性，普通PCR方法的检测下限（LOD）可分别达到25拷贝和12.5拷贝，实时荧光PCR方法的LOD均为10拷贝，在进境康乃馨种苗等样品中未检出该基因。综上，本研究建...     

嗜线虫致病杆菌HB310菌株对苹掌舟蛾的生物活性

苹掌舟蛾[Phalera flavescens（BremeretGery）]又称为苹果舟形毛虫，属鳞翅目舟蛾科，是我国蔷薇科果树和花卉上的重要食叶害虫，分布广泛，大发生时可将全树叶片食光，影响产量，危及树势。因为苹掌舟蛾幼虫发生为害高峰在8—9月份，已经到达果实的成熟期，化学药剂防治不但污染环境，还会造成果实的农药残留超标。多年来，昆虫病原线虫一共生菌复合体作为生防制剂在生产中成功地用于防治地下害虫或钻蛀类害虫，但是该复合体对叶面害虫防治效果较差。自Bowen从昆虫病原线虫共生菌发光光杆状菌（Photorhabdus luminescens）中发现并分离纯化出具口服杀虫活性的蛋白后，已经陆续发现多种昆虫病原线虫共生菌具有口服杀虫活性，并从中克隆了多个杀虫基因。线虫共生菌的研究已经引起人们广泛关注，能否应用于植物叶面害虫的防治也正在成为人们关注和研究的重点。     

PCR法证实棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫经卵和蛹的垂直传播

根据棉铃虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因设计5’引物和3’引物，通过PCR技术成功扩增389bp的目的片段，并对该片段进行了克隆和测序。结果表明，扩增片段为棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因序列。该检测方法的灵敏度为10fg，应用此技术从带毒的虫卵和蛹的总DNA中也检测到该病毒的存在。该方法从分子水平上证明了病毒的垂直传递。     

参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶基因分析

为了解参与烟粉虱免疫反应的clip丝氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in Bemisia tabaci,Bt CLIPs)基因,对已鉴定的8个Bt CLIPs基因编码的蛋白进行序列分析,与冈比亚按蚊、家蚕、黑腹果蝇、烟草天蛾4种模式昆虫的同源蛋白进行系统进化分析,并通过q RT-PCR检测球孢白僵菌侵染烟粉虱4龄若虫后Bt CLIPs的时间表达模式。结果显示,8个Bt CLIPs基因均为含有CLIPs结构域的丝氨酸蛋白酶基因;Bt CLIP19、Bt CLIP20和Bt CLIP21独自聚在进化树的一支上;其它Bt CLIPs均与4种模式昆虫中的1种或多种同源蛋白聚在一起;与对照相比,8个Bt CLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同时间的相对表达量均上调,但诱导程度不同,48 h的相对表达量达最高,其中Bt CLIP19上调表达最明显,为对照组的71倍。研究表明,8个Bt CLIPs可能参与烟粉虱对真菌侵染的免疫反应,并成为烟粉虱生物防治的新靶标。     

寄生性膜翅目昆虫和生物多样性

生物多样性（Biologicaldiversity）的指世界生物种类的多样性，包括遗传多样性和它们所形成的集合体（生境、群落和生态系等）的多样性，即多样化的生命实体群的特征。这是自然界生物学的财富，是人类生活的健康的保证，生物多样性也广泛的反应了基因、种和生态系的相互关系。l寄生性膜翅目昆虫在生物多样性中的地位1．1寄生性膜翅目昆虫的数量据统计昆虫的种数要超过世界上已描述的生物种数的1／2以上，这些种类在陆地生态系中比其他任何动物类群对自然界能产生更大的影响，而寄生性膜翅目昆虫是昆虫中较大的类群之一。据最近统计已描述…     

马铃薯Y病毒CP基因的原核表达及免疫金标试纸条的研制

选取马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）代表株（NC＿001616.1）外壳蛋白基因37～281区间，采用化学合成方法合成目标序列，将其连接到原核表达载体pET-32a（+），并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达出45 kDa融合蛋白，回收后免疫日本大耳白兔制备抗血清。Western Blot分析多克隆抗体特异性良好，后制备25 nm胶体金，标记PVY CP37-281多克隆抗体，制备胶体金免疫层析试纸条。结果表明，试纸条能在15 min内检出PVY,PVY病株汁液检测稀释限度可达106倍（W/V），使用常见复合侵染烟草检测，未出现交叉反应。由此可知，该试纸条操作简便，反应灵敏特异，适用于田间一线及种薯生产中马铃薯Y病毒的检测。     

鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

丽蝇蛹集金小蜂P450基因家族的发现和分子进化分析

丽蝇蛹集金小蜂是一类重要的天敌昆虫,大量地应用于生物防治中。虽然寄生蜂不是化学农药的直接作用靶标,但其在自然环境中可能接触到化学农药。P450基因家族是昆虫产生抗药性的重要原因之一,同时也参与了昆虫激素的合成与降解。因此,研究P450基因家族对充分利用丽蝇蛹集金小蜂,以及保护其免受农药毒杀具有重要的意义。本文利用生物学信息方法从丽蝇蛹集金小蜂基因组筛选到91个P450基因。家族分析表明,丽蝇蛹集金小蜂具有15个P450基因超家族、27个亚家族。对P450基因的正选择和基因转换开展了进一步分析,研究发现5个基因族存在正选择位点,2个基因族存在基因转换,正选择和基因转换之间存在明显的关联性。各个亚家族的选择压力分析表明,CYP9P亚家族受到选择压力最大（ω=118．9355）。通过MEME程序在丽蝇蛹集金小蜂P450基因上识别到5个频率为90％以上的motif,其中“LAE[NH]P”为新发现的motif.     

禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Ha-cbp-1)的克隆和序列分析

 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-cbp-1（GenBank 注册号GQ178086）cDNA序列。Ha-cbp-1基因cDNA包含1个开放阅读框,编码131个氨基酸残基的蛋白质,预测蛋白由1个长度为18氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域（CBD）组成。Ha-cbp-1的基因组DNA序列含有2个内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白（HA-CBP-1）序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白（HG-CBP-1）序列有60%的同一性和76%的相似性,与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白（HS-CBP-1）序列有60%的同一性和75%的相似性。本研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。