丙酮酸激酶在高等植物中的作用

介绍了丙酮酸激酶的活性及同工酶,阐述了丙酮酸激酶的代谢调控,分析了丙酮酸激酶缺失对植物的影响,并检索了水稻丙酮酶激酶基因。     

大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶的表达· 纯化及鉴定

[目的]获得大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7软件对不同生物丙酮酸激酶的编码基因进行聚类分析;通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶基因pykA,将其克隆到pET_28a载体中,构建了重组质粒载体pET_28a-pyk A并在大肠杆菌BL21中实现了Ⅱ型丙酮酸激酶(PykA)的高效表达;利用镍柱亲和层析系统纯化了PykA蛋白,并进行了高效液相色谱(HPLC)检测。[结果]聚类分析结果表明,大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶与其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC检测发现Ⅱ型丙酮酸激酶Pyk A在体外可以高效地将ADP转化为ATP。[结论]该研究获得了Ⅱ型丙酮酸激酶,为ATP的合成以及Ⅱ型丙酮酸激酶为基础的ATP再生系统的研究提供了参考。     

红细胞丙酮酸激酶活性测定

导致非球形红细胞溶血性疾病的先天性酶缺陷中,除6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏外,较重要与较常见的尚有丙酮酸激酶缺乏,国内已有这种病例报道。根据我们的经验,一些筛检方法如荧光斑点试验等并不理     

新生儿脐血红细胞丙酮酸激酶活性筛查与定量测定

红细胞丙酮酸激酶(PK)缺陷在国内尚少报道。本文目的在于以 PK 活性定量测定,及荧光斑点(筛查)试验两种,测定其正常值范围,并进而探讨荧光斑点试验的应用价值与应用标准,现将方法与结果报告如下。     

猪血浆中糖原酵解酶活性与氟烷基因型及肌肉品质的相关性

本文以４０头猪的试验材料研究了血浆中丙酮酸激酶，磷酸果糖激酶，乳酸脱氢酶和氟烷基因型及ＰＳＥ肉的相关。研究结果表明：氟烷阳性ＨＡＬ＾ｎｎ基因型猪血浆丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶极显著地高于氟烷阳性ＨＡＬ＾ＮＮ基因型猪（Ｐ＜０．０５），而且血浆丙酮酸激酶及磷酸果糖激酶的对数值与肌肉品质指标ｐＨ值存在显著相关性（Ｐ＜０．０１）；血浆丙酮酸激酶活性值及对数值也与其他肉质指标如系水力和光反射值存在较高相关（Ｐ＜     

卷首语

<正>本期以下4篇论文值得关注:国家油菜改良中心付三雄博士采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一种油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶基因。试验通过设计引物克隆了丙酮酸激酶基因的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Notl和Xhol酶切,酶切产物连接到新近改造的RNAi平台载体的Notl和Xhol位点,利用多重PCR技术证实载体构建成功,然后将丙酮酸激酶基因反向重复框克隆到加入启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的丙酮酸激酶基因的RNAi载体。     

卷首语

<正>本期以下4篇论文值得关注:国家油菜改良中心付三雄博士采用基因芯片技术,从油菜中鉴定了一种油分积累优势表达基因即丙酮酸激酶基因。试验通过设计引物克隆了丙酮酸激酶基因的siRNA靶序列,连接到pEASY-T1载体上,采用Notl和Xhol酶切,酶切产物连接到新近改造的RNAi平台载体的Notl和Xhol位点,利用多重PCR技术证实载体构建成功,然后将丙酮酸激酶基因反向重复框克隆到加入启动子的pCAMBIA1390表达载体相应的酶切位点上,构建具有种子特异性表达的丙酮酸激酶基因的RNAi载体。     

桃小食心虫滞育过程中5种代谢酶活力变化

为明确桃小食心虫越冬适应机制,室内利用试剂盒测定了不同滞育时间桃小食心虫滞育幼虫的海藻糖酶、山梨醇脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸激酶和碱性磷酸酶的活力。结果表明,不同滞育时间桃小食心虫体内海藻糖酶、己糖激酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸激酶活力差异显著,而山梨醇脱氢酶活力差异不显著。海藻糖酶活力在滞育初期最高,而后随着滞育时间的延长逐渐降低;己糖激酶活力在滞育初期较低,在滞育后期先迅速升高再迅速下降;丙酮酸激酶在滞育中期活力最高,而碱性磷酸激酶活力在滞育初期最高。这表明桃小食心虫在滞育过程中通过代谢酶的调节,提高其越冬期间的抗寒能力,保证顺利越冬。     

新生儿脐血红细胞己糖激酶的测定及其正常值

己糖激酶(HK)活性的测定对非球形红细胞溶血性贫血的诊断有一定意义。新生儿己糖激酶的正常值国内未见报道,本文介绍新生儿脐血红细胞 HK 的定量测定法及其正常值。     

猪囊尾蚴体内发育过程中能量代谢变化规律的研究

研究猪囊尾蚴体内发育过程中能量代谢变化规律,应用分光广度法系统地测定了体内发育过程中猪囊尾蚴磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、丙酮酸激酶(PK)、延胡索酸还原酶(FR)、异柠檬酸脱氢酶(ICD)、苹果酸酶(ME)活性的变化及葡萄糖(GLC)含量、乳酸(LAC)含量的变化。结果表明,随虫体发育PEPCK、FR、ICD成升高趋势,PK活性和PK/PEPCK比值呈下降趋势,GLC和LAC略有升高。提示随虫体生长发育PK代谢通路减弱而PEPCK通路增强。     

清远麻鸡宰后肉质酸化现象的研究

为了探讨鸡宰后肌肉的酸化规律,选择了168日龄清远麻鸡的腿肌和胸肌为材料,分别检测了宰后不同时间点(45min、6h、12 h、18 h、24 h)肌肉的pH值,乳酸含量,己糖激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活性的变化.结果显示,己糖激酶和乳酸脱氢酶的活性变化与乳酸含量的变化相关,而丙酮酸激酶活性基本不变.乳酸含量6h后开始升高,12h后达到最大值,而pH值在屠宰后6h降到最低值,此后基本不变,表明肌肉中pH值的下降主要由乳酸含量的上升引起.     

猪肌肉组织中糖原酵解酶活性和PSE肉的相关性

本文用２０头猪的肌肉样品研究了肌肉纺织中丙酮酸激酶，磷酸果糖激酶，乳酸脱氢酶和ＰＳＥ肌肉的相关性。结果表明：屠宰后４５ｍｉｎ采取的肌肉中ＰＫ和ＰＦＫ活性在正常骨肉和ＰＳＥ肌肉之间差异极显著（Ｐ＜０．０１）。并且ＰＫ与常规肉质指标ｐＨ值，系水力和光反射值存在显著相关性（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１）。     

饲料中不同碳水化合物水平对翘嘴红鲌生长及血液指标和糖代谢酶的影响

选用540尾翘嘴红鲌,随机分成高、中、无碳水化合物3组,每组设3个重复.日粮保持总能一致,以等量可消化糖替代等量蛋白,即分高碳水化合物组(含可消化糖23.98%(以下均为质量分数),粗蛋白40.53%)、中碳水化合物组(含可消化糖14.45%,粗蛋白50.14%)、无碳水化合物组(含可消化糖为0,粗蛋白63.38%),饲养8周,测定鱼体血液指标、糖代谢酶活性及生长等指标.试验结果表明:与无碳水化合物组比较,中碳水化合物组显著增加了血液胆固醇含量,降低了己糖激酶活性(P＜0.05);高碳水化合物组显著降低了增重率、特定生长率、肌肉粗蛋白及粗灰分含量(P＜0.05),显著增加了血糖含量、葡萄糖激酶含量、丙酮酸激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量(P＜0.05).与中碳水化合物组相比,高碳水化合物组也显著增加了肝体比、血液甘油三酯含量、葡萄糖激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量(P＜0.05),无碳水化合物组显著降低了胆固醇含量(P＜0.05).两者之间其他指标差异不显著.因此高糖日粮可诱导翘嘴红鲌肝脏葡萄糖激酶、丙酮酸激酶等糖代谢酶活性,促进了营养物质在肝脏等内脏中沉积,但是可能不利于生长.     

饲料中不同碳水化合物水平对翘嘴红鲌生长及血液指标和糖代谢酶的影响

选用540尾翘嘴红鲌,随机分成高、中、无碳水化合物3组,每组设3个重复.日粮保持总能一致,以等量可消化糖替代等量蛋白,即分高碳水化合物组(含可消化糖23.98%(以下均为质量分数),粗蛋白40.53%)、中碳水化合物组(含可消化糖14.45%,粗蛋白50.14%)、无碳水化合物组(含可消化糖为0,粗蛋白63.38%),饲养8周,测定鱼体血液指标、糖代谢酶活性及生长等指标.试验结果表明:与无碳水化合物组比较,中碳水化合物组显著增加了血液胆固醇含量,降低了己糖激酶活性(P＜0.05);高碳水化合物组显著降低了增重率、特定生长率、肌肉粗蛋白及粗灰分含量(P＜0.05),显著增加了血糖含量、葡萄糖激酶含量、丙酮酸激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量(P＜0.05).与中碳水化合物组相比,高碳水化合物组也显著增加了肝体比、血液甘油三酯含量、葡萄糖激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量(P＜0.05),无碳水化合物组显著降低了胆固醇含量(P＜0.05).两者之间其他指标差异不显著.因此高糖日粮可诱导翘嘴红鲌肝脏葡萄糖激酶、丙酮酸激酶等糖代谢酶活性,促进了营养物质在肝脏等内脏中沉积,但是可能不利于生长.     

玉米高光效基因ppdk的克隆及其生物信息学分析

[目的]获得玉米(Zea mays)的丙酮酸磷酸双激酶基因(以下简称ppdk),并对其进行生物信息学分析.[方法]使用Trizol提取玉米SC704的总RNA,并用特异引物对其进行RT-PCR扩增,将得到的cDNA片段连接到pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析.[结果]获得的玉米PPDK基因CDS全长2781bp,与玉米z561ppdk基因同源性为99;;其编码的多肽链包含926个氨基酸,与玉米PPDK同源性为97;.[结论]克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,它所编码的氨基酸序列具备PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心区域.该基因的成功克隆为今后利用其改造C3植物的光合效率以提高粮食单产奠定了良好的基础.     

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析

[目的]获得玉米的PEPC基因,并对其生物信息学进行分析。[方法]使用RT-PCR方法由玉米中获得PEPC全长c DNA,构建克隆载体后进行测序,并对其序列进行生物信息学分析。[结果]获得的玉米PEPC基因CDS全长2 913 bp,编码的多肽链包含970个氨基酸,为疏水性氨基酸,由α-螺旋(61.44%)、无规则卷曲(34.43%)和延伸链(4.12%)组成,定位于细胞质,不存在跨膜结构域,其175~970位氨基酸组成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能结构域,在173~184、597~609位具有2个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位点。[结论]该研究克隆了玉米C_4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,它所编码的氨基酸序列具备PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心区域。     

饲料中不同碳水化合物水平对翘嘴红铂生长及血液指标和糖代谢酶的影响

选用540尾翘嘴红铂，随机分成高、中、无碳水化合物3组，每组设3个重复。日粮保持总能一致，以等量可消化糖替代等量蛋白，即分高碳水化合物组（含可消化糖23．98％（以下均为质量分数），粗蛋白40．53％）、中碳水化合物组（含可消化糖14．45％，粗蛋白50．14％）、无碳水化合物组（含可消化糖为0，粗蛋白63．38％），饲养8周，测定鱼体血液指标、糖代谢酶活性及生长等指标。试验结果表明：与无碳水化合物组比较，中碳水化合物组显著增加了血液胆固醇含量，降低了己糖激酶活性（P〈0．05）；高碳水化合物组显著降低了增重率、特定生长率、肌肉粗蛋白及粗灰分含量（P〈0．05），显著增加了血糖含量、葡萄糖激酶含量、丙酮酸激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量（P〈0．05）。与中碳水化合物组相比，高碳水化合物组也显著增加了肝体比、血液甘油三酯含量、葡萄糖激酶活性、肝胰脏粗蛋白及粗脂肪含量（P〈0．05），无碳水化合物组显著降低了胆固醇含量（P〈0．05）。两者之间其他指标差异不显著。因此高糖日粮可诱导翘嘴红铂肝脏葡萄糖激酶、丙酮酸激酶等糖代谢酶活性，促进了营养物质在肝脏等内脏中沉积，但是可能不利于生长。     

(-)-羟基柠檬酸调控鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的机制

[目的]本文旨在研究(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制。[方法]选用含(-)-HCA的培养液孵育鸡胚原代肝细胞后,油红染色法检测鸡胚原代肝细胞中脂滴的数量和总面积;试剂盒法检测鸡胚原代肝细胞中甘油三酯、葡萄糖含量及糖代谢、呼吸链关键酶活性。[结果](-)-HCA处理显著降低鸡胚原代肝细胞中甘油三酯含量、脂滴数量和总面积,但对细胞活力和死亡率无显著影响。(-)-HCA处理提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖消耗量,显著降低了柠檬酸裂解酶活性和细胞质中乙酰辅酶A含量。(-)-HCA处理显著提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶(E1)、乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、NADH脱氢酶和ATP合酶活性。[结论](-)-HCA通过抑制柠檬酸裂解酶的活性减少细胞质中乙酰辅酶A的供给,并通过增强糖代谢和呼吸链中关键酶活性而加速能量代谢,最终抑制了鸡胚原代肝细胞中脂滴的沉积。     

家稗丙酮酸磷酸双激酶序列分析及三维结构建模

【研究目的】目前已从许多种植物中克隆了其PPDK基因,但是对于其蛋白结构的分析尚未报道,此文通过生物信息学方法对家稗PPDK的序列进行了分析,并对其三维结构进行了建模分析;【研究方法】利用DNASTAR、Vector NTI 9、SignalP等生物信息学平台对[Echinochloa crusgalli var frumentacea(Roxb.)W.F.Wight]丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate orthophosphate dikinase)进行了序列分析和三维结构建模;【研究结果】家稗丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)同来自于高等植物的PPDK具有较高的同源性,无信号肽,存在17个跨膜结构区,二级结构是由许多螺旋、转角和少量折叠构成。同时在一二级结构分析的基础上,利用同源建模的方法完成了三维结构的建模。【结论】家稗PPDK蛋白同来自高等植物中的更为相近,无信号肽,有17个跨膜结构区,其三维结构为一同源四聚体。     

玉米C_4型PPDK基因的分段PCR克隆及其表达载体构建

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4植物和景天科酸代谢(CAM)植物光合作用的关键酶,催化形成固定CO2的初始分子受体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。玉米的C4型PPDK基因序列较长,难以直接克隆。本研究设计多对引物,首先利用常规PCR扩增PPDK启动子,再利用分段PCR扩增PPDK基因全长编码序列;测序证实克隆序列正确无误,最后利用In-Fusion技术将各个片段定向克隆至载体p CAMBIA-1391Z,成功构建了玉米C4型PPDK基因的植物表达载体。最终为C4型PPDK基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列,为全长基因的高效克隆及表达载体构建提供参考。