壳寡糖对黄曲霉毒素B1诱导大鼠肝细胞毒性损伤的干预作用

为了研究壳寡糖（COS）对黄曲霉毒素B1（AFB₁）诱导大鼠肝细胞（BRL 3A细胞）毒性损伤的干预作用。采用CCK-8法分别测定AFB₁对细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）和COS对细胞的无损害作用浓度;用试剂盒检测COS预处理细胞6 h后再加入AFB₁继续培养24 h的细胞存活率、活性氧（ROS）水平、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性和细胞凋亡率;通过Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）测定Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1、Bax和Bcl-2基因的mRNA相对表达量;最后通过RNA-seq研究分析差异表达基因的层次聚类和富集途径。结果：AFB₁对BRL 3A细胞的IC₅₀为15.86 μmol/L,COS浓度小于125 μmol/L时不会对细胞造成毒性损伤;COS可以缓解AFB₁引起的细胞内ROS水平和MDA含量升高,增强SOD和GST酶活性,进而提高细胞自身的抗氧化能力,降低细胞凋亡率;AFB₁可引起促凋亡基因Bax的显著表达（P<0.05）,并显著降低Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1的转录水平（P<0.05）,而COS预处理则能显著提高Nrf2、Keap1、Ho-1、Nqo1基因的表达（P<0.05）,显著降低Bax的表达水平（P<0.05）;在RNA-seq的富集途径结果中,COS还可能通过细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路途径来缓解AFB₁诱导的细胞毒性损伤（P<0.05）。结果表明：COS预处理对AFB₁诱导大鼠肝细胞的毒性损伤具有干预作用,其机制可能与Nrf2信号通路、细胞色素P450对外源物质的代谢作用、药物代谢-细胞色素P450和p53信号通路有关。     

黄曲霉毒素B1对奶山羊生产性能和血液指标的影响

为了研究黄曲霉毒素B_1(AFB_1)对奶山羊生产性能和血液指标的影响,选择20头健康泌乳崂山奶山羊随机分为2组,每组10头,分别饲喂2种不同处理日粮,即在基础日粮中添加0、50μg·kg~(-1)纯AFB_1(干物质基础)(对照组和AFB_1组)。整个试验为期21 d,前7 d为预饲期,后14 d为正式期。AFB_1组奶山羊的产奶量和采食量显著降低(P0.05),乳糖含量显著增加(P0.05)。奶山羊摄入AFB_1后血液白细胞数量、血小板显著降低(P0.05),平均红细胞体积和平均血小板体积极显著降低(P0.01),而红细胞数量极显著增加(P0.01),血红蛋白含量显著增加(P0.05)。饲粮添加AFB_1奶山羊血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量显著增加(P0.05),碱性磷酸酶含量显著降低(P0.05)。上述结果表明,50μg·kg~(-1) AFB_1能显著降低奶山羊的产奶量,导致血常规指标出现异常,对奶山羊肝脏功能产生负面影响。     

饲料中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒的研制与应用

建立一种简单、快速、灵敏、准确的黄曲霉毒素B1的ELISA检测方法,并使其在饲料检验中广泛应用。在生产抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体基础上,利用间接竞争ELISA方法,研制出饲料中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒。该试剂盒对黄曲霉毒素B1最低检出浓度为0.05 ng/mL,标准曲线的线性范围为0.05~2.00ng/mL;对3种饲料做3个加标水平添加回收率试验,回收率在79.5%~106.2%之间。     

食用油中黄曲霉毒素B1含量的测定能力验证

[目的]浅析影响食用油中黄曲霉毒素B₁检测结果的因素。[方法]根据国标GB 5009.22—2016高效液相色谱柱后光衍生法并优化试验条件。[结果]能力验证样品中黄曲霉毒素B₁含量为3.66μg/kg,相关系数为0.999 9,采用甲醇水(70+30)溶液提取和3 mL/min的净化速率,加标回收率为98.7%,RSD为0.73%。通过了中国国家认证认可监督管理委员会开展的能力验证《食用油中黄曲霉毒素B₁含量的测定》(NIL PT-1637),Z比分数为0。[结论]能力验证结果满意,完善了国标测定黄曲霉毒素B₁的细节操作,为广大分析测试人员提供参考。     

黄曲霉毒素B1高灵敏定性定量免疫层析检测方法的建立

  目的  真菌毒素可污染农产品和动物源性食品,其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性强、危害大,建立AFB₁快速、高灵敏和便捷的检测方法对于监测相关产品中AFB₁污染水平,保障人和动物健康均具有重要意义。基于侧向层析技术原理,采用竞争模式,优化建立免疫层析检测方法,以实现AFB₁的快速定性检测和定量分析。  方法  通过比较分析不同粒径金颗粒标记抗体效果,优化确定免疫层析各组分材料类型、相关缓冲液配方及最佳使用质量浓度,建立AFB₁高灵敏定性定量免疫层析检测方法。  结果  优化建立的AFB₁免疫层析检测法在实际样本中的定性和定量检测限分别为2.5和0.5 μg·kg?1,灵敏度高、特异性强,与其他常见真菌毒素无交叉反应,加标回收实验结果显示:该方法准确稳定,且对AFB₁天然污染样本的定量检测结果与商品化试剂盒及LC-MS/MS一致性较好。  结论  本研究制备的免疫层析检测法可用于样本中AFB₁污染的快速定性检测与定量分析,适合缺乏实验条件的基层检验检疫机构和农产品加工企业对大量样本进行快速筛查,样本检测结果疑似阳性再采用仪器法进行确认,可降低检测成本,提升检测效率,同时为建立其他病原微生物免疫层析检测方法提供参考。图9表2参26     

金标免疫层析试条检测样品中黄曲霉毒素B1的误差分析

为了扩大金标免疫层析试条(GICA)检测食品和饲料中黄曲霉毒素B1的应用范围,研究了样品基质对试剂条信号强度的影响,探讨了GICA测定饲料和各种发酵类食品样品时,提取液中NaCl、金属离子(Fe3+,Cu2+,Pb2+,As3+)和脂肪含量对检测结果的影响,并研究了消除影响的方法。结果表明,3种阴性样品(大米、玉米和小麦粉)均存在不同程度的非特异性干扰,大米的影响最小,其次为玉米和小麦粉,大米的最佳稀释倍数为10倍,玉米和小麦粉为30倍;随NaCl质量浓度增加,检测结果有偏向假阳性的趋势;4种金属离子对检测结果的影响程度依次为Fe3+>Cu2+>Pb2+>As3+;随着样品中油脂含量的增高,用GICA检测结果偏阳性的程度加剧。对粗提取液用氯仿法萃取后挥干再溶解,可将盐离子和重金属离子对测定的影响控制在允许范围之内;用石油醚脱脂,可使油脂对测定结果的影响降到最低。     

黄曲霉毒素B_1单克隆抗体修饰金电极检测饲料中的黄曲霉毒素B_1

[目的]建立使用黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰金电极测定饲料中黄曲霉毒素B1的新方法。[方法]试验采用电化学方法优化检测条件,建立标准曲线并对样品进行检测。[结果]试验得出,黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰金电极检测饲料中黄曲霉毒素B1的最优条件为:电极修饰条件为4℃、8 h,磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。该检测方法对黄曲霉毒素B1的线性检测范围为1.427～150.000ng/ml,加标回收率在94.44%～101.36%。[结论]使用该免疫电化学方法,检出限较低,可以用于饲料中黄曲霉毒素的检测。     

玉米粉中伏马毒素B1和B2基体参考物质的研制

通过将产毒镰刀菌接种于玉米培养基,获得了含大量伏马毒素B₁(FB₁)和伏马毒素B₂(FB₂)的基质样本,与空白玉米粉逐级稀释后,获得了玉米粉中FB₁和FB₂基体参考物质。采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法对制备得到的基体参考物质进行均匀性、稳定性检验,并采用6家实验室联合定值的方法对参考物质进行定值和不确定度评估。结果表明,制备得到的参考物质均匀性、稳定性良好,符合标准物质技术规范;参考物质中FB₁和FB₂的定值结果分别为1.07±0.09 mg/kg和0.43±0.07 mg/kg;该参考物质可用于玉米粉中FB₁和FB₂的定性和定量检测。     

三种吸附剂对饲喂黄曲霉毒素B1泌乳初期至中期奶牛降低黄曲霉毒素M1的有效性

本试验旨在确定3种吸附剂Soils（SO,Novus国际公司）、NovasilPlus（NOV,美国安格公司）和试验采用结核菌-100（MTB,美国奥泰奇公司）分别添加在含黄曲霉毒素（AF）日粮中,对奶牛乳中AFM1的影响。采用3个重复的4×4拉丁方设计,选择12头平均泌乳天数为163d的泌乳初期至中期奶牛,依据胎次、体重和产奶量分组,不限量采食和饮水。在4个连续的7d,每个重复时期,母牛随机分组,饲喂4个日粮配制。日粮配制为：AF组（112肛gAFB1·kg饲料千物质M）、SO组：AF＋O．56％SO、NOV组：AF＋0．56％NOV和MTB组：AF＋0．56％MTB。在每个试验期的第6、7天收集奶样.结果表明,所有处理的采食量、产奶量、乳脂率、乳蛋白率和线性体细胞评分不受日粮配制的影响,4组平均分别为22．20kg·d、33．87kg·d^-1、3．78％、2．95％和1．60％。AF从饲料到牛奶的转化率4组分别为2．65％、1．48％、1．42％和2．52％,每天分泌到乳中的AFM。分别为66、37、35和63μg·d^-1。在含AF饲料中添加SO和NOV显著降低乳中AFM,浓度（SO组为45％,NOV组为48％）和AFM,的分泌（SO组为44％,NOV组为46％）。相反,MTB组对降低乳中AFM．浓度（4％）、AFM,分泌（5％）以及AF从饲料到乳的转化无效。结果表明,占日粮0．56％的SO组和NOV组对采食舍12μgAFB1·kg^-1日粮DM的母牛降低乳中AFM,浓度是有效的。     

壳寡糖对三氧化二砷致大鼠肝细胞毒性的保护作用

为研究壳寡糖(COS)对三氧化二砷(ATO)致大鼠正常肝细胞(BRL-3A)毒性的保护作用,测定三氧化二砷和壳寡糖对BRL-3A细胞的增殖抑制率、三氧化二砷诱导壳寡糖预处理BRL-3A细胞的细胞存活率、细胞内乳酸脱氢酶(LDH)水平、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和线粒体膜电位(MMP)的变化.结果表明,三氧化二砷对BRL-3A细胞的半数抑制浓度(IC50)为19.8 μmol,L-1,壳寡糖浓度低于230 μmol·L-1时对细胞并未产生损伤.壳寡糖预处理BRL-3A细胞24 h,三氧化二砷再处理细胞24 h,通过检测以上指标表明壳寡糖预处理能够降低LDH水平至176.23％±5.87％,从而降低三氧化二砷引起的细胞毒性;壳寡糖可显著抑制三氧化二砷引起的脂质过氧化对机体造成的损伤作用,MDA相对释放含量降低至191.91％±2.89％;壳寡糖显著提高了抗氧化酶GST、SOD和CAT的活性,分别提高至86.20％±1.41％、90.09％±1.33％和61.29％±0.21％,提高细胞的抗氧化能力,降低三氧化二砷引起的细胞氧化应激损伤;壳寡糖预处理可减缓三氧化二砷引起的线粒体膜电位的降低,降低三氧化二砷对细胞的线粒体产生的伤害.壳寡糖对三氧化二砷引起的大鼠肝细胞的细胞毒性损伤起到了有效地保护作用.     

壳寡糖对高脂血症小鼠降血脂及肝脏保护的作用

通过建立高脂血症小鼠模型来研究壳寡糖对小鼠降血脂及肝脏保护的作用。将昆明种小鼠分为正常组、高脂血症模型组、壳寡糖组和脂必妥对照组,喂养7周后,测定血清中总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇脂(HDL-C)的含量,丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性以及肝脏中丙二醛(MDA)、总巯基(T-SH)、非蛋白结合巯基(NP-SH)和蛋白结合巯基(PB-SH)的含量。结果表明,壳寡糖使高脂血症小鼠血清中TC含量、ALT和AST活性显著降低,HDL-C/TC显著升高,显著提高了肝脏中T-SH的含量,降低了肝脏中的MDA含量。说明壳寡糖具有明显降血脂和保护肝脏的作用。     

云南松苗木生长对GA3和壳寡糖浸种及缓释肥的响应

【目的】了解赤霉素（gibberellin,GA₃）和壳寡糖（chitosan oligosaccharide,COS）溶液浸种结合基质施缓释肥的组合对云南松苗木生长及其针叶光合色素含量的影响,为短期内培育无蹲苗期壮苗提供科学依据。【方法】从15年生的1.5轮实生种子园采集云南松种子,采用L₉(3⁴)正交试验,开展不同质量浓度GA₃（0.1,0.2和0.3 g/L）和COS（1,3和5 g/L）溶液浸种结合基质施缓释肥（0.5,1.0和1.5 kg/m³）的育苗试验,以不浸种和不施肥的处理作为对照。在苗龄70,110和140 d时,测定苗木地径和苗高生长量,并于苗龄140 d时测定其针叶光合色素含量,筛选促进苗高生长的无蹲苗期壮苗培育的最优组合。【结果】苗龄70,110和140 d时,各处理组合的苗木地径分别为0.9~1.1,1.1~1.5和1.9~2.3 mm,苗高分别为3.5~5.0,7.3~9.6和8.7~12.0 cm,对照地径分别为1.0,1.1和2.1 mm,苗高分别为3.7,7.0和9.2 cm;苗龄140 d时,各处理组合苗木针叶叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量分别为0.43~0.67,0.19~0.27,0.62~0.94和0.08~0.13 mg/g,对照上述色素含量分别为0.52,0.20,0.72和0.10 mg/g;各处理组合间以上指标均具有显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）差异。除苗龄140 d时影响苗木地径生长的主导因子是COS外,其他苗龄阶段影响各指标的主导因子均为基质施缓释肥。【结论】外源激素和养分浸种结合基质施缓释肥可促进云南松苗木生长及其针叶光合色素的积累;无蹲苗期的云南松壮苗培育以促进苗高生长为主,0.2 g/L GA₃和1 g/L COS浸种结合基质施1.0 kg/m³缓释肥的组合,在110 d时即可培育出苗高达到出圃要求的无蹲苗期壮苗。     

饲料中添加壳寡糖对刺参肠壁菌群的影响

为研究饲料中添加壳寡糖对刺参Apostichopus japonicus肠壁菌群的影响,在刺参基础饲料中分别添加0.25%(G1)、0.50%(G2)、0.75%(G3)和1.00%(G4)的壳寡糖,另设对照组(G0),养殖50 d后采集各组刺参幼参(5.03 g±0.03 g)肠壁样品,并采用高通量测序技术分析刺参肠壁菌群结构特征。结果表明:壳寡糖添加组刺参肠壁的细菌多样性和丰度均高于对照组;各组样品肠壁优势菌门均为变形菌门和厚壁菌门;壳寡糖对刺参肠壁菌群组成产生了明显影响,对照组优势菌属为希瓦氏菌属Shewanella,而壳寡糖添加组希瓦氏菌属的相对比例均下降,对照组芽孢杆菌属Bacillus的相对比例较低,而壳寡糖添加组芽孢杆菌属的相对比例均较高或成为优势菌属;1.00%壳寡糖组各类菌属相对比例均较低,高浓度壳寡糖出现抑制现象。研究表明,饲料中添加壳寡糖可提高刺参肠壁细菌多样性和丰度,明显改善刺参肠壁菌群结构。     

壳寡糖对大熊猫轮状病毒VP6-VP7亚单位疫苗免疫作用的研究

为研究壳寡糖(COS)对大熊猫轮状病毒(GPRV)重组蛋白VP6-VP7的免疫增强作用,以原核表达的重组VP6-VP7蛋白为抗原,添加浓度为2.0 mg·mL^-1 COS作为免疫佐剂制成GPRV VP6-VP7-COS亚单位疫苗。选取SPF级昆明小鼠78只随机分为4组。PC组免疫纯化的重组VP6-VP7蛋白,A组免疫VP6-VP7-COS疫苗,B组免疫VP6-VP7氢氧化铝胶佐剂疫苗,NC组注射PBS(对照组)。在0、15、30 d进行免疫接种,每次接种完成后于每周每组随机挑选6只小鼠采血分离血清,分别检测小鼠血清IgG、IgA抗体效价、T淋巴细胞转化率、细胞因子的含量,评估COS对GPRV重组VP6-VP7蛋白诱导的免疫应答反应的调节作用。试验结束后,取各组小鼠注射部位的肌肉组织进行病理组织学分析,以评价COS作为免疫佐剂的安全性。结果表明,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组、VP6-VP7-COS组免疫小鼠血清中所产生的IgG均显著(P<0.05)高于其他各组。VP6-VP7-COS组小鼠产生的IgA抗体含量显著(P<0.05)高于其他各组,VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组和VP6-VP7-COS物理混合组诱导T淋巴细胞增殖的能力显著(P<0.05)高于VP6-VP7蛋白组。VP6-VP7-COS组、VP6-VP7-氢氧化铝胶佐剂组中IL-2、IL-4、IL-5及IFN-γ的含量均显著(P<0.05)高于其他组,组织病理学分析结果表明,以COS作为佐剂的VP6-VP7亚单位疫苗免疫小鼠后注射部位的肌肉组织未出现病理变化。本研究表明,GPRV重组蛋白VP6-VP7能够显著诱导动物机体的免疫应答,壳寡糖对GPRV VP6-VP7蛋白呈现较好的免疫增强效果。本研究为研制安全、无副作用和高免疫保护力的GPRV 亚单位疫苗提供了参考。     

乳酸菌对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

将前期体外筛选获得的具有良好抗氧化功能的鼠李糖乳杆菌LVg、嗜热链球菌grx02、屎肠球菌ST1、婴儿双歧杆菌BF以及普通菌株鼠李糖乳杆菌C8M（普通对照）进行急性酒精性肝损伤小鼠试验,各乳酸菌组按每千克体重胃管灌服含乳酸菌数为10^8、10^7、10^6cfu.mL^-1的脱脂乳发酵液10 mL,连续15 d,第15天时与模型组同时按每千克体重灌服50%酒精12 mL,对照组灌等量蒸馏水,禁食12 h后处死,检测血清中谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）及肝匀浆中丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脱氢酶（ADH）水平,观察肝脏病理学变化。结果表明：与模型组比较,乳酸菌组ALT、AST、MDA水平显著降低,ALB、TP、GSH、SOD、ADH水平显著升高。4株优选乳酸菌保肝效果明显优于对照组,且grx02组总体效果最佳,某些指标（MDA、SOD）上保护效果虽与空白组无显著差异,但优于药物组。     

饲料中黄曲霉毒素B_1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇对鲤鱼的联合毒性研究

为了探讨黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)两种真菌毒素单独或联合应用对水产养殖的影响,本试验选用鲤鱼270尾(体重为(18±0.1)g),均分为9组,每组设3个平行,2个平行组进行试验观察和统计,1个平行组作为试验过程中解剖检查用。试验采用二因素三水平设计,AFB1的含量分别为0、0.05和0.1mg·kg-1,DON的含量分别为0、1和5mg·kg-1。试验期为40d。每20d进行增重、体长、丰满系数的检测。试验结束时进行肝胰脏重/体重值、血清生化指标(碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP))检测以及肝胰脏、脾脏和肠道的组织学检查。试验结果表明:除1mg·kg-1DON组外,其他7个试验组鲤鱼的增重都明显受到抑制(P<0.05),但在体长、丰满系数等方面差异不显著(P>0.05)。生化指标中AST活性增加明显(P<0.05)。肝脏的病理变化为肝细胞变性、坏死;肠道为肠黏膜脱落、绒毛萎缩,而毒素对脾脏的影响较小。两种毒素联合作用后毒性具有一定的协同效应。