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10株牛源非结核分枝杆菌16S rRNA基因序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究应用结核分枝杆菌的16S rDNA序列分析方法,鉴定非结核分枝杆菌菌株。应用PCR方法从10株牛源非结核分枝杆菌中扩增16S rDNA基因5'端片段并测序。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank中分枝杆菌序列相比较,计算种间相似性,构建系统发育树,对菌株进行分类与鉴定。结果显示,10株牛源非结核分枝杆菌中浅黄分枝杆菌1株;偶发分枝杆菌1株;母牛分枝杆菌2株;新金色分枝杆菌4株;另有2株N8和N9分别与新金色分枝杆菌和偶发分枝杆菌有较好的亲缘关系。检测结果提示,非结核分枝杆菌在牛群中存在应引起重视,而且它们对人畜的致病性需要进一步研究,以便采取有效的防制措施确保人类及畜群的健康。 相似文献
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目的:利用可以鉴别分支杆菌属中结核分枝杆菌、牛分支杆菌、非结核分枝杆菌多重PCR方法,检测奶牛场麻雀组织中分支杆菌感染情况。方法根据结核分枝杆菌种特异基因目的片段MTP40、分枝杆菌属特异基因32kD、结核分枝杆菌复合群特异基因IS6110插入序列,设计合成三对特异性引物,扩增对32kD的506bp、MTP40的396bp和IS6110的984bp片段,以此方法检测奶牛场麻雀肺组织中分支杆菌感染情况,并对阳性结果的目的片段进行克隆测序。结果在分析的21份麻雀肺组织中,检测出2例非结核分枝杆菌阳性病料,阳性率9.52%。2例阳性样本PCR扩增得到的片段与GenBank收录的32kD基因同源性分别为95.8%和97.2%。结论麻雀肺组织中存在分支杆菌感染阳性病例提示该牛场中生物体内存在分支杆菌潜伏感染,并可能导致奶牛的潜伏感染以及干扰结核检疫。 相似文献
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本试验对从吉林省不同区域的7个城市采集的503份牛颌下淋巴结样品和497份牛肠系膜淋巴结样品进行非结核分枝杆菌的流行情况的调查,样品均采自结核(副结核)变态反应阴性牛只,调查中得到阳性样品25份,阳性率2.5%,其中颌下淋巴结阳性率1.59%,肠系膜淋巴结阳性率3.42%,成功分离扩增培养出14株非结核分枝杆菌,并进行了分类鉴别,得到母牛分枝杆菌1株,龟分枝杆菌脓肿亚种2株,苏加分枝杆菌2株,偶发分枝杆菌1株,蟾蜍分枝杆菌6株,胞内分枝杆菌2株.调查结果表明:非结核分枝杆菌单独感染的情况不容乐观,应加强对非结核分枝杆菌的检验检疫工作. 相似文献
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牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用 总被引:12,自引:0,他引:12
根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列,设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物,建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段;对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测,结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性,阳性符合率为90%(9/10);而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性,阴性符合率为100%(10/10)。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。 相似文献
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本研究旨在建立一种快速鉴定分枝杆菌的三重PCR方法,并比较分析其在临床检测中的可靠性。根据已发表的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌rv 3036c基因,结核分枝杆菌rv 1970f基因(RD7)和牛分枝杆菌pncA基因的序列,改造并设计合成了3对特异性扩增引物,建立了一种能对分枝杆菌样品进行初步鉴定的三重PCR方法。结果显示该方法可针对rv 3036c、rv 1970f和pncA基因分别扩增出大小为500、125和249 bp的目的片段,能特异性检测出结核分枝杆菌(500和125 bp两条带)和牛分枝杆菌(500和249 bp两条带),并可将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与其他分枝杆菌加以区分。本方法的检测灵敏度为50 pg/μL模板基因组DNA。对86株抗酸染色阳性菌进行三重PCR鉴定,鉴定结果与细菌16S rDNA和ITS序列测定结果一致,检测准确度为100%,优于生长特征和生化试验鉴定。 相似文献
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结核分枝杆菌与牛分枝杆菌全基因组比较分析 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究旨在揭示结核分枝杆菌与牛分枝杆菌全基因组的遗传差异,为结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别诊断提供新的分子标志。利用结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌AF2122/97的全基因组测序结果,通过在线比对,完成了两者的全基因组比对分析。结果显示AF2122/97相对H37Rv存在14处大片段缺失,大小范围为0.8~12.7kb,其中RD18、RD19及RD20等3处缺失为首次报道。此外,AF2122/97还存在6处基因内部小片段的缺失,大小范围为12~714bp,其中Mb1319及Mb3293c基因内部缺失为首次报道。H37Rv相对AF2122/97存在6处大片段缺失,大小范围为1.3~5.4kb。此外,H37Rv还存在5处基因内部小片段的缺失,大小范围为10~48bp,这些基因的内部缺失都为首次报道。通过结核分枝杆菌H37Rv和牛分枝杆菌AF2122/97的全基因组序列比对,揭示了这2种菌株间的遗传差异,阐述影响表型特征、寄主偏好性及毒力差异的关键性遗传基础。这些新的认识将有助于开发新的药物、诊断试剂和疫苗。 相似文献
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利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。 相似文献
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为建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,本研究根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列,以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测,并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明,建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌,也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右,可检测到7拷贝/反应。另外,用3种方法同时检测样品发现,LAMP与细菌培养的符合率为90.91%,LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100%。LAMP检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(3)
为进一步确定新疆某规模化牛场疑似奶牛副结核病病原,本研究从PCR检测阳性牛粪便样本中共分离获得4株细菌,对其进行菌落形态观察、抗酸染色镜检以及16S r RNA、IS900特异性基因及亚型分型基因的扩增、序列测定与分析。结果显示,所分离的4株细菌为抗酸染色阳性菌,对其IS900基因及亚型分型基因检测均为阳性,它们的16S r RNA、IS900基因及亚型分型基因之间同源性为100%,与Gen Bank中登录的副结核分支杆菌序列同源性在99%以上,从而确定所分离的4株菌株均为Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。 相似文献
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为了建立禽分枝杆菌多重PCR方法,给禽分枝杆菌亚种鉴定及禽结核病的诊断提供参考。本实验根据国外报道的诊断方法设计4对特异性引物,选用我国禽结核参考菌株(CVCC 68201)基因组DNA为模板,优化了退火温度,测定了DNA最小检测量,并进行了特异性检验。采用优化好的多重PCR体系,对国家兽医微生物菌种保藏中心保存的禽分枝杆菌标准菌株进行检测和分类。实验结果表明,禽结核参考菌株(CVCC 68201)能很好的扩增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)三条目的条带,基因组DNA的最小检测量为0.38 ng/μL,目的条带在退火温度50 ℃~62 ℃之间均能得到有效扩增。对23株禽分枝杆菌菌株检测,并设立牛分枝杆菌作为阴性对照,最终将禽分枝杆菌菌株分为三大类:禽亚种/森林土壤亚种、副结核亚种、人猪亚种,与国家兽医微生物菌种保藏中心的分类结果相比不仅一致且更加详尽而有临床意义。因此,基于分子生物学方法建立的多重PCR方法可以对禽分枝杆菌亚型进行快速鉴定并对禽结核病的诊断提供参考。 相似文献
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本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102~103基因拷贝或3.6~6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法,所建立的四重PCR-DHPLC方法能实现快速检测结核分枝杆菌复合群并鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌 相似文献
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为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的三重PCR方法,本研究以M bovis ValleeⅢ株染色体DNA 为模板,分别以其recA、IS6110、IS1081基因特异性引物进行PCR扩增,建立检测M.bovis的recA-IS6110-IS1081三重PCR反应.通过PCR扩增获得大小约为860 bp、520bp和340 bp的DNA片段.BLAST序列分析表明,这3个基因片段与GenBank中登录的相关基因的核苷酸序列同源性均达到99%.同时,recA、IS6110和IS1081PCR扩增的敏感性分别达到585fg、19.5fg和19.5fg.特异性较强,只有M.bovis和人结核临床分离株扩增反应为阳性,为进一步研究recA、IS6110和IS1081基因以及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础. 相似文献
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为了解牛结核分枝杆菌临床分离菌株对利福平(RFP)、异烟肼(INH)的分子耐药机制,本研究采用噬茵体生物扩增法对分离并鉴定的25株牛结核分枝杆茵进行药敏分析.筛选出9株耐利福平、异烟肼菌株.PCR扩增耐药株rpoB基因片段(213bp)和KatG基因片段(458bp)并测序.通过对耐药基因的测序分析,5株利福平耐药株rpoB基因在53l位(RNA聚合酶β-亚基编码基因起始密码子起,下同)、526位点、511位点发生突变,其中有3株rpoB基因531位点发生突变,1株rpoB基因526位点突变;1株rpoB基因在531位点和511位点发生了较为少见的联合突变;4株异烟肼耐药菌株,其中2株在315位点(KatG蛋白编码基因起始密码子起,下同)发生碱基突变,2株在463位点发生碱基突变. 相似文献
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簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)系统是一种针对入侵核酸的可遗传性原核适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可以产生高度特异性的基因双链断裂,并通过非同源末端连接(NHEJ)或者同源重组(HR)进行修复,如今已经成为许多生物方便有效的基因组编辑工具。结核分枝杆菌因其基因操作的复杂性,其基因组研究存在诸多困难,因此,CRISPR/Cas系统的出现对结核分枝杆菌的研究具有里程碑式意义。本文围绕CRISPR/Cas系统在结核分枝杆菌中的应用,综述了国内外最新的研究进展,为结核分枝杆菌研究方法的选择提供参考。 相似文献