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1.
【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。 相似文献
2.
为摸索适宜甜樱桃的SSR反应体系,利用正交设计对Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA等5种因素4个水平进行筛选和优化,20μL反应体系中,Mg2+、dNTPs和引物的最适浓度为1.5mmol/L、0.2mmol/L、0.4μmol/L,Taq酶宜加入1U,模板DNA应加入10~40ng;引物的最佳退火温度为56.0~62.8℃。用10对引物及建成的反应体系对10个供试品种扩增,6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,共有29个等位位点,证实该体系稳定可靠。 相似文献
3.
枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化 总被引:6,自引:1,他引:6
首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。 相似文献
4.
苹果SSR反应体系的建立 总被引:15,自引:1,他引:15
为摸索适宜苹果的SSR反应体系,以金冠苹果为试验材料,研究了苹果SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合苹果的SSR反应体系为:在20μL反应体系中,Mg2+、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5mmol/L、0.8μmol/L、0.10mmol/L;反应体系中TaqDNA聚合酶宜加入1U,模板DNA应加入15-30ng;引物的最佳退火温度为48.5-52.0℃。并利用该反应体系对10个苹果代表品种进行SSR反应,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。 相似文献
5.
菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化 总被引:1,自引:0,他引:1
为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。 相似文献
6.
以山梨为试材,提取基因组DNA,运用5因素5水平正交实验设计,对SSR反应体系中的DNA模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和引物用量进行优化试验,确立适宜的SSR反应体系。结果表明:20μL反应体系中,模板DNA 10ng、Mg2+(20mmol/L)2.5μL、Taq酶1.25U、dNTPs(10mmol/L)1.0μL、引物(10μmol/L)1.5μL、10×PCR buffer 2.0μL;应用该SSR体系,在引物筛选试验及山梨×"幸水"后代群体中进行扩增,扩增效果较好,证实了该体系的适用性和稳定性。 相似文献
7.
以大葱嫩叶为试材,采用单因素试验和正交实验探讨了Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、模板DNA以及Buffer用量对大葱ISSR-PCR扩增的影响,建立了大葱ISSR反应体系。结果表明:优化后的最佳反应体系为10μL反应体系中,10×Buffer缓冲液1.0μL,Mg~(2+)浓度为2.0mmol·L~(-1),dNTPs浓度为0.3mmol·L~(-1),引物浓度为0.65μmol·L~(-1),Taq酶1.0U,模板DNA为60ng,用灭菌的超纯水补齐体积至10μL。对大葱71份样品材料进行ISSR-PCR扩增体系的检测结果显示,该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高,为大葱种质ISSR分子标记遗传结构分析提供参考依据。 相似文献
8.
辣椒SSR反应体系的优化 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。 相似文献
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10.
结球甘蓝SSR检测体系的建立及优化 总被引:1,自引:1,他引:0
摘,要:以结球甘蓝自交系15R(南宝)和14S(北黑大平头)为试材,建立了甘蓝SSR-PCR反应体系,并从
PCR反应组成、扩增程序等环节对SSR-PCR反应体系进行了优化。即10.00 μL反应体系组成为:1×
Buffer(含20.00 mmol·L-1 MgCl2)、50.00 μmol·L-1 dNTPs、0.40 U Taq DNA聚合酶、0.40 μmol·L-1
SSR引物、1.00 μL DNA(60.00 ng·μL-1),加ddH2O至终体积10.00 μL;对基本扩增程序作了改进,适
宜的扩增程序为:94 ℃预变性5 min后进行20个迫降循环,94 ℃变性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸
1 min,每个循环降低0.5 ℃;再进行15个循环,94 ℃变性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;72
℃延伸10 min,16 ℃保存。对PCR产物的电泳检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(银染法)。 相似文献
11.
12.
板栗SSR和RAPD技术体系的建立 总被引:6,自引:1,他引:6
主要从板栗DNA提取、PCR条件的优化等环节对SSR和RAPD的反应条件进行了优化。结果表明,采用PVP和β-巯基乙醇联合除酚,用多次洗涤和高盐相结合进行除糖提取高质量板栗基因组DNA,所获得的DNA完整,无降解,分子量在23kb以上,可扩增、可酶切,D260nm/D230nm在2.0以上,D260nm/D280nm为1.8~2.0,产率为40~300μgDNA/g叶组织,完全满足SSR、RAPD、AFLP等分子标记技术分析的需要。采用单因素对PCR反应体系中各个影响因素进行优化,结果表明对PCR结果影响最为明显的是退火温度和Mg2+浓度的变化。对退火温度和Mg2+浓度进行优化,确定RAPD的PCR反应体系Mg2+浓度为2.0mmol/LMgCl2,退火温度38℃;SSR反应体系Mg2+浓度为2.0mmol/L,退火温度56℃。建立了一套完善的适用于板栗的SSR和RAPD分析的稳定技术体系。 相似文献
13.
核桃SSR反应体系的优化 总被引:14,自引:1,他引:14
以清香、香铃、爱米格为试材,利用CTAB法提取基因组DNA,将PCR体系的主要成分设定5个梯度,根据每个成分的变化引起的PCR-SSR的效果差异,探讨了核桃SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物WGA321的适宜退火温度进行优化。最终确定了引物WGA321的最适退火温度为48~52℃,PCR反应体系的最佳条件为:15μL体系中,Mg2+1.0mmol/L,dNTPs浓度0.40mmol/L,TaqE用量为0.5U,DNA模板1.0ng/μL,引物浓度为0.4μmol/L。利用此反应体系对部分核桃品种进行PCR扩增并电泳检测,扩增结果清晰且有较高的多态性,表明该体系适合核桃的亲缘关系分析。 相似文献