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运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒 总被引:1,自引:0,他引:1
柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。 相似文献
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《园艺学报》2019,(8)
柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,优化影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增4种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系扩增的特异片段大小分别是CTLV 889 bp、CYVCV 612 bp、CTV 462 bp和CLBV 294 bp,扩增产物清晰,特异,检测灵敏度较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍。采用多重RT-PCR和单重RT-PCR对收集到的59份田间样品分别进行检测,结果显示2种方法检测结果一致,4种病毒的检出率在11.9%~54.2%之间。建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、灵敏地检测单一或复合侵染的4种柑橘病毒。 相似文献
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中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究 总被引:2,自引:0,他引:2
柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。 相似文献
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为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV),根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。 相似文献
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柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
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探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,以及序列比较。结果表明HH和XLB与其各自在不同柑橘植株上的亚分离株的CP/Hinf I RFLP酶切图谱无明显差异;混合侵染的CTLV分离株HH和其亚分离株之间的SSCP谱型存在差异,株系构成单一的CTLV分离株XLB与其亚分离株间的SSCP谱型差异不明显。通过序列分析进一步证实CTLV在不同寄主上其CP基因有几个核苷酸位点发生了变异。CTLV可能受寄主植物的影响发生了变异。 相似文献
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柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。 相似文献
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选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。 相似文献
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柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用 总被引:1,自引:0,他引:1
为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng~(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。 相似文献
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对温州蜜柑带来为害的病毒病种类有柑桔衰退病毒(CTV)、柑桔碎叶病毒(CTLV)、柑桔裂皮类病毒(SEV)和温州蜜柑萎缩病毒(SDV).在考虑这些病毒病的对策时,完全可以按同类方法进行处理。 高糖系温州是温州蜜柑中的一个系统,它们都患有柑桔衰退病毒,只是病状程度不同而已,温州蜜柑通常对该病毒具有抗性,即使带毒也很少表现病征。 相似文献
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