甜菜素合成相关基因BvDDC1的克隆与表达分析

甜菜素是一种重要的天然色素,具有广阔的应用前景。为探究调控甜菜素合成关键基因BvDDC1功能,本研究测定了不同生长阶段甜菜‘Yellow chard’的甜菜素含量和BvDDC1的相对表达量,同时采用同源克隆技术获得BvDDC1基因序列,并对其进行生物信息学分析及功能预测。结果表明:甜菜叶片中甜菜素含量随甜菜生长时间的延长呈现上升趋势,且BvDDC1在不同时期甜菜叶片中均有表达,呈现先上升后下降的趋势。甜菜素含量越高,BvDDC1表达量越高。BvDDC1序列全长为1509 bp,编码502个氨基酸,编码蛋白不具有跨膜结构,预测其在膜外发挥作用。系统进化树显示与菠菜亲缘关系较近,同源性最高。本研究结果可为解析甜菜素生物合成提供科学依据。     

烟草脱水素基因NtDEH1的克隆及研究

为研究脱水素在植物早期胚胎发育中的作用和机理,采用显微操作技术获得烟草卵细胞并构建其c DNA文库,从中筛选到一个脱水素基因NtDEH1。通过RACE技术获得该基因全长,基因组测序结合生物信息学分析表明该基因拥有一段长度为651 bp的完整开放阅读框和一段535 bp的内含子,编码由217个氨基酸残基组成的蛋白质,其理论等电点为5.27,属于酸性蛋白,且具有一定的亲水性。氨基酸序列比对分析发现在许多物种比如绒毛状烟草、林烟草、甜辣椒、番茄、马铃薯和丹参中都具有与NtDEH1蛋白非常类似的保守的同源序列,均具有SK2型脱水素特征。借助Genome walking技术获取NtDEH1基因约1 706 bp的5'侧翼序列,使用小叶烟草瞬时表达系统检测到其具有较强的启动子活性。该研究为进一步了解脱水素基因NtDEH1在植物生殖发育中的具体功能打下基础。     

棉花生长素结合蛋白ABP1基因cDNA的克隆及序列分析

生长素结合蛋白(ABP1)在植物细胞发育中起着重要作用.在ABP1蛋白的保守区设计引物,利用RT-PCR和RACE方法,首次克隆了棉花ABP1基因cDNA的3'和5'末端.测序及生物信息学分析表明,该基因cDNA全长824 bp编码190个氨基酸,它所编码的氨基酸序列包含植物ABP1蛋白家族的所有特征,被命名为GhABP1.棉花ABP1所包含的Box A,Box B和Box C区在植物ABP1家族中是高度保守的.它的C末端氨基酸残基WDE在蛋白质的折叠及ABP1在质膜上的功能活性方面都具有重要的作用.棉花ABP1的C末端带有KDEL残基区,这个KDEL区表明它被定位在内质网上.用Clustal W软件进行多重比对分析表明,棉花ABP1与拟南芥、向日葵、油菜、辣椒、甘菊的氨基酸序列同源性分别为72%,72%,71%,70%和70%.系统进化分析表明,棉花在进化上与萝卜、拟南芥和油菜聚为一类.序列分析表明此基因为生长素结合蛋白基因家族的新成员.     

玉米素合成通路相关基因的克隆及表达

高温已成为近年来世界范围内制约玉米生产的最重要的非生物胁迫因素之一,然而对玉米耐高温胁迫的分子机理的认识还十分有限。本试验选取中地88(耐高温胁迫)和先玉335(不耐高温胁迫)两个玉米品种为试验材料,在42℃高温和28℃常温两种条件下研究其花粉中玉米素合成通路相关基因的表达情况。结果表明,共有5个玉米素合成相关基因,即Zmco5、Zmit4、Zmco4b、Zmco12和Zmczg1,基因编码蛋白的氨基酸数目分别为582、364、534、528、465个。进一步对这5个基因表达蛋白作了生物信息学分析,包括常见理化性质、功能位点、磷酸化修饰、二级结构和三级结构等,结果表明,不同蛋白其生物学表型存在差异。基因表达结果显示,对于耐高温胁迫的中地88,这5个基因表达差异达到2倍以上,以常温条件为对照,Zmco5基因表达上调,其余为表达下调。但对先玉335的Zmco5和Zmczg1基因表达上调,其余3个基因表达下调。这5个基因均处于玉米素合成通路中,与细胞内玉米素的生物合成密切相关。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与表达分析

植物防御素具有广谱抗菌活性,不仅具有抗真菌、抗细菌、蛋白酶抑制和昆虫淀粉酶抑制等活性,而且参与调节植物的生长和发育。本研究根据白菜防御素基因序列设计引物,从甘蓝型油菜中克隆获得5个防御素基因,其c DNA全长325~461 bp,含有177~243 bp开放阅读框,编码58~80个氨基酸,含有8个保守Cys残基,具备Knot1功能域。系统进化分析表明,Bn PDF2.1、Bn PDF2.3、Bn PDF2.5与拟南芥PDF2亲缘关系较近,可能具有蛋白酶抑制活性。荧光定量分析表明,防御素基因具有组织表达特异性,在花蕾和叶中表达量较高,角果中次之;经1 mmol L–1水杨酸处理开花期油菜2 h后,防御素基因在茎、花蕾、角果中的表达量均有不同程度的上调,但在叶中表达有所下调,在根中表达无明显变化。     

水蛭素的HPLC色谱分析条件优化研究

为研究水蛭素的HPLC最佳色谱分析条件,通过对比重组水蛭素的HPLC分析方法的洗脱条件、检测波长、色谱柱的分离效果,拟合水蛭素浓度与峰面积的线性方程,优选最佳水蛭素色谱分析条件。结果显示,ODSC18柱分析最佳条件为：采用梯度洗脱,流动相A和B洗脱程序：0～60 min,B:0%～100%,进样量20μL,柱温35℃,流速为1 mL/min,波长205 nm;TSKgelG2000SW柱最佳分析条件为：流动相磷酸缓冲液(0.02 mol/L,pH 7.0),流速0.5 m L/min,检测波长205 nm,进样量20μL。研究表明,水蛭素浓度与峰面积具有良好的直线线性相关关系,采用TSKgelG2000SW色谱柱的分析效果优于ODSC18柱,可为动物活性多肽的分析提供依据。     

BNYVV CP基因的克隆及载体构建

以甜菜丛根病根或病叶总RNA为模板，经反转录PCR扩增合成编码BNYVV CP的全长cDNA，将其克隆于pUCm-T载体上，获得了重组质粒pUCm-T／CP。经序列分析，此cDNA为一个567bp长的开放阅读框架，编码由188个氨基酸组成的病毒外壳蛋白。又将CP基因构建到植物双元载体pROKII中。最后通过三亲融合，得到了融合农杆菌LB4404。     

杜仲胶合成相关基因EuFPS的克隆及序列分析

本文采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，以杜仲树叶总RNA为模板扩增出杜仲法呢基焦磷酸合酶基因EuFPS，克隆至质粒pUCm-T中。序列分析表明，所克隆的cDNA序列全长1271bp，开放阅读框共编码320个氨基酸残基，其核酸序列与拟南芥菜、银胶菊和巴西橡胶树FPP合酶的序列同源性分别为81％，87％，82％。     

稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆

简述了稻瘟病抗性的两种类型,着重阐述了稻瘟病主效抗性基因的分子定位和克隆的研究进展,概述了主要分子标记的种类及其特点,分析了图位克隆法在克隆植物抗病基因中的应用,对其存在的技术瓶颈进行了探讨,并指明了克服这些技术难点的途径。     

甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析

以甜菜品种甜研7号叶片的cDNA为模板,采用RT-PCR和3′/5′RACE技术,获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR)的cDNA全序列2 014 bp, 包含有1 830 bp的开放阅读框,编码599个氨基酸。所推导的氨基酸序列与菠菜及拟南芥NiR编码的氨基酸序列均具93%的同源性。生物信息学分析表明,甜菜NiR具有完整的NiR蛋白结构,含血红素蛋白β-化合物区域和4Fe-4S区域, 并利用分析软件预测其三维结构。实时荧光定量结果显示,在以0、10、20、30、40、50、80和160 mmol L^–1 NO₃^–-N处理72 h的试验中,50 mmol L^–1处理可使甜菜NiR的表达量达到最大;以0、2、4、8、16、32、64和128 mmol L^–1 NH₄⁺-N处理48 h的试验表明,8 mmol L^–1和64 mmol L^–1处理条件下甜菜NiR表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理48 h的试验中,NO₃^–-N和NH₄⁺-N比例为80:20可使甜菜NiR的表达量达到最大;在氮素诱导的基础上,蛋白抑制剂放线菌酮处理9 h,随着处理浓度的增大,NiR的表达量逐渐下降;不同浓度NO₂^–处理的试验中,40 mmol L^–1处理下NiR的表达量最大。     

薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表达及酶活性检测

从高油薰衣草品种“杂花”中克隆得到芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2,并对其进行了生物信息学和表达模式分析、原核表达和酶活性检测,以低油品种“法国蓝”为对照。结果表明,LIS1基因编码602个氨基酸,LIS2基因编码564个氨基酸。LIS1蛋白与阔叶薰衣草、一串红的芳樟醇合酶亲缘关系相近,LIS2蛋白与狭叶薰衣草、杂薰衣草的芳樟醇合酶亲缘关系相近。LIS1基因在“杂花”花器官半开期、盛开期和衰败期的表达量均高于“法国蓝”;LIS1基因在“杂花”花萼中的表达量最高,且仅在“法国蓝”雄蕊中少量表达。LIS2基因在“杂花”花器官不同组织和不同发育时期表达量均低于其在“法国蓝”中表达量,该基因在“杂花”花器官衰败期和“法国蓝”花器官半开期表达量最高,在2个品种花萼中高表达。LIS2基因在2个品种不同发育时期及组织中的表达量均明显高于LIS1基因。LIS1和LIS2重组蛋白具有单萜合酶活性,且均参与合成芳樟醇。     

甘蔗中性/碱性转化酶基因(SoNIN1)的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖, 在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列, 基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp (GenBank登录号为JX109944), 开放阅读框为1812 bp, 编码603个氨基酸, 相对分子量为67.79 kD, 等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域, N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近, 属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5¢侧翼启动子序列, 长度为1174 bp (GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件, 参与分生组织特异性激活, 参与干旱诱导的MYB结合位点, 脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术, 在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达, 其表达量在叶中最高, 芽中次之, 而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

一个棉花GDSL脂肪酶基因的克隆与功能分析

GDSL脂肪酶与GXSXG脂肪酶是2个重要的脂肪酶亚家族。其中, GDSL家族脂肪酶具有水解酶活性, 能水解多种酯类物质。本试验根据新乡小吉无绒无絮(XinWX)和无绒有絮(XinFLM)近等基因系纤维起始期29K芯片竞争杂交结果, 选择了一个在纤维起始期具有极显著表达差异的EST序列(GenBank登录号为DR458916), 以该序列信息为探针, 利用电子克隆方法并进行cDNA及基因组全长基因PCR扩增、测序验证, 克隆获得一个陆地棉GDSL脂肪酶基因(GhGDSL;GenBank登录号为KC186125)。该基因ORF长1065 bp, 编码354个氨基酸, 含有5个外显子和4个内含子。该基因在二倍体棉种基因组中含一个拷贝, 在四倍体棉种基因组中含2个拷贝。序列比对显示该基因在四倍体棉种的2个亚组中独立进化, 且D亚组比A亚组变异大。染色体定位显示该基因2个拷贝分别位于A4 (Chr. 4)和D4 (Chr. 22)染色体上。定量RT-PCR结果表明, GhGDSL在开花后3~10 d的纤维组织中表达量高, 其中在海7124中表达高峰在8DPA, 在TM-1中表达高峰从5DPA持续到10DPA。利用[(TM-1×Hai7124)×TM-1]的BC₁S₁群体开展GhGDSL功能与纤维、种子品质性状关联分析, 发现该基因A亚组的拷贝与种子脂肪含量存在显著相关(P=0.048);D亚组的拷贝与种子蛋白含量存在极显著相关(P=0.008)。推测GhGDSL基因功能与种子中脂肪、蛋白代谢相关, 同时也参与纤维伸长过程。     

草莓果实多酚氧化酶基因的克隆及序列分析

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）是一类植物体内广泛存在的由核基因编码的能与铜结合的金属蛋白酶。它是诱导许多果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因,同时在植物的生长发育、抗病虫害及果实品质形成等方面也起到了一定的作用。本文用RACE的方法,从草莓幼果cDNA中成功扩增出PPO基因的3′端部分序列。序列分析表明该基因片段编码424个氨基酸。与其他物种PPO核苷酸序列比较相似性为72％-80％,氨基酸相似性为82％～87％。草莓多酚氧化酶基因的成功克隆,为草莓抗褐变的研究及果实品质的改良打下了坚实的理论基础。     

牦牛 Agouti 基因的克隆及编码区多态性研究

以Agouti基因作为牦牛毛色调控的候选基因,探索Agouti基因编码区序列多态性,以期为阐明Agouti与毛色形成的相关性及毛色形成机理奠定基础。根据GenBank已发表序列（ NM_206843）设计1对引物,以天祝白牦牛和黑色被毛甘南牦牛皮肤总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增,成功获得了牦牛Agouti基因编码区序列。采用生物信息学方法预测分析Agouti基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、疏水性、二级结构等;采用DNA混合池测序法和直接测序法,检测牦牛Agouti基因编码区的序列变异。结果表明,扩增得到的Agouti基因的编码区是一条长为593 bp的DNA序列。黑色甘南牦牛和天祝白牦牛皮肤的Agouti基因序列相同,并与黄牛基本一致。将牦牛的Agouti基因序列命名为YAK ASIP,并且在NCBI数据库中注册该基因的登录号为KJ630463。该基因含有一个长度为402 bp的开放性阅读框,编码133个氨基酸。 Agouti基因编码蛋白属于亲水性蛋白,有一个明显的信号肽,含有多个磷酸化位点。其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主。 Agouti基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛Agouti与黄牛、绵羊等物种的Agouti氨基酸具有高度相似性,并且牦牛Agouti基因编码区中无多态性位点。     

莲膨胀素基因的克隆及其序列分析

膨胀素是一类存在于植物细胞壁上,并能快速缓冲张力,使植物细胞壁松驰的蛋白质。以中国莲幼叶总RNA反转录所得的cDNA为模板,设计简并引物,用PCR方法成功扩增出expansin部分序列,经克隆测序,得到长度在531-532bp的序列共3个,编码177个氨基酸,而且均存在expansin的保守区域。与其它物种,如杂交杨树、烟草、杂交葡萄、野马铃薯、樱桃等物种的expansin相比,核苷酸相似性为84％-85％,氨基酸序列相似性为86%-99％。莲expansin的成功克隆为研究莲的生长发育以及莲品种的改良等打下了良好的基础。     

球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解HFW-05菌株的几丁质酶特性。根据已发表的几丁质酶基因序列(EU828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增HF-WBbchit1全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD19-T连接获得含有HFWBbchit1全长基因的重组质粒pMDchit1并测序。该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kDa,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株NCIM1216几丁质酶基因(EU828354)和球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶基因(AY145440)的核苷酸同源性最高,同源性达到98%。氨基酸序列与球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶(AAN41259)同源性达到99%。