农杆菌介导水稻幼胚转化获转基因植株

本研究以根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）为供试菌株,以水稻幼胚为供试材料,对影响农杆菌介导基因的转化效率的因素进行了研究,确立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。采用所确立的转化体系转化了Ｒａｄｏｎ、中国９１、０２４２８ ３个水稻品种（系）幼胚,结果表明,ｇｕｓ Ａ基因的瞬时表达率均在７０％左右,最高为７６％;ｇｕｓ Ａ基因稳定表达率均在２０％以上,平均为２３％。转基因植株的ＧＵＳ活性检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,外源基因事于水稻基因组中,进行了有效地表达,且能稳定地遗传给后代,外源基因在后代遗传符合孟德尔遗传规律。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的建立

以玉米(Zea mays L.)HiII的幼胚为外植体,β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)为报告基因,通过农杆菌介导转化法对影响遗传转化体系的外植体大小、农杆菌浓度、热预处理温度、侵染时间、共培养及恢复培养时间、抗生素、筛选剂等因素进行优化,以建立农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系。结果表明,幼胚大小为1.0~1.5 mm,农杆菌菌液的OD600 nm为0.5,40℃热处理3 min,侵染8 min,共培养3 d和恢复培养4 d,100 mg/L羧苄青霉素作为抑菌剂,双丙氨膦作为筛选剂时为最佳遗传转化条件。通过该优化体系已获得多种转基因玉米材料,表明该体系具有较高的可重复性和可靠性。     

农杆菌介导的水稻基因转化

以水稻的两个亚种籼稻和粳稻作为受体,比较了不同外值体、vir诱导物等对根癌农杆菌转化的影响,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。依据该体系,以粳籼DREW的幼愈伤组织和籼稻D汕B的幼穗愈伤组织为受体,经农杆菌AGL1／pCAMBIA1301转化后,获得了超过50%的潮霉素抗性愈伤筛选率,并获得再生植株。     

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究

以水稻基因组测序品种日本晴为研究材料,对根癌农杆菌介导的水稻转化系统进行了优化。结果表明,对水稻种子采用2.5%次氯酸钠灭菌30 min的处理,愈伤组织的诱导率最高;获得的胚性愈伤组织经过6-7 d的继代培养后再转化,转化效率最高;感染时,发杆菌浓度OD600值为0.145-0.190时,转化效率较高;将抗性愈伤组织进行7 d的暗培养将大大提高分化效率。对获得的大量转化体进行初步分析,GUS表达率达到30%。     

农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系

【目的】以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’幼胚为受体材料,开展农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的遗传转化研究,揭示影响香榧遗传转化的关键因素,以建立农杆菌介导的香榧幼胚遗传转化体系。【方法】以香榧种子突破种鳞后第8周至第11周的幼胚作为转基因受体材料,比较受体胚龄、农杆菌菌液浓度、侵染时间、抗生素质量浓度对遗传转化效率的影响,并采用潮霉素、绿色荧光蛋白GFP表达及GFP基因聚合酶链式反应对遗传转化香榧幼胚培养物进行阳性筛选。【结果】随着胚龄的增加,香榧幼胚抗逆性增强,污染率降低,成活率提高,第10周和第11周幼胚成活率分别为52.1%和52.3%。农杆菌菌液浓度和侵染时间均对香榧幼胚的污染率、成活率、愈伤组织诱导率以及体胚发生率具有显著影响(P<0.05)。菌液吸光度[D(600)]为0.5时,香榧幼胚愈伤组织诱导率和体胚发生率最高,分别为17.9%和17.3%;侵染时间为10 min时,愈伤组织诱导率和体胚发生率为最高,分别达17.5%和17.1%。羧苄青霉素对于受体材料的农杆菌脱除具有显著影响(P<0.05),当羧苄...     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系探索

对根癌农杆菌介导的水稻遗传转化受体系统的几个重要因素进行试验,得到157个抗性愈伤组织.对于滇优粳3号和滇优粳5号,4mg/L的2,4-D和0.2mg/L的6-BA搭配,蔗糖浓度为20～30g/L时比较有利于愈伤组织形成.滇优粳3号和滇优粳5号的愈伤组织对潮霉素较敏感,30～50mg/L的潮霉素浓度为有效的筛选浓度.     

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系的研究

[目的]对新疆推广种植的水稻品种进行组织培养,探索适合新疆水稻品种的遗传转化条件,为新疆水稻的遗传改良工作奠定基础.[方法]以新疆3个水稻品种成熟胚诱导的良好胚性愈伤组织为受体,以SiPEBP为目的基因,应用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化,同时以抗性愈伤率为依据,对影响转化的愈伤诱导率、农杆菌侵染浓度、时间和共培时间进行优化研究.[结果]在NB培养基中添加2 mg/L的2,4-D的愈伤诱导率高;相比25℃、暗培养,28℃、持续光照培养可使诱导率提高到100;,且缩短了诱导周期;在OD600值为0.3的农杆菌菌液浓度,侵染愈伤30 min,共培养2d,同时添加一张无菌滤纸,有利于提高转化效率;通过培养条件的优化,3个水稻品种的抗性愈伤率均达到40;以上.[结论]新疆水稻农杆菌转化的几个主要因素,建立了农杆菌转化体系.     

农杆菌介导羽衣甘蓝转化体系的建立

以羽衣甘蓝皱白1带柄子叶为外植体,通过农杆菌介导法,研究影响羽衣甘蓝转化的若干因素,建立稳定的遗传转化体系.结果表明,外植体通过2 d的预培养,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间5 min,2 d的共培养,延迟筛选3 d有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,外源基因已整合到羽衣甘蓝基因组中.     

冬小麦遗传再生体系及根癌农杆菌介导的转化研究

以临优145的幼胚为外植体诱导植株再生,并进行农杆菌转化研究.以冬小麦品种临优145的幼胚为外植体,消毒后用解剖刀挑取幼胚,盾片朝上接种于MS+2,4-D 2 mg/L+肌醇100 mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+40 g/L麦芽糖+8 g/L琼脂的培养基中诱导愈伤组织,每2周继代一次,将诱导出的淡黄色、颗粒状Ⅱ型胚性愈伤组织接种于分化培养基(MS+ZT 1 mg/L+IAA 1mg/L+MES 400 mg/L+CH 100 mg/L+麦芽糖40 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)上培养2-3周,然后转接到再生培养基(1/10 MS+NAA 0.5mg/L+KT0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+gelrite 2.6 g/L,pH 5.8)中进行再生成苗.接种1229块幼胚,得到987块愈伤组织,Hyg抗性愈伤组织123块,抗性再生植株34株.在建立了再生体系的基础上,用根癌农杆菌介导法将GUS基因导入幼胚愈伤组织,抗性植株的PCR检测呈阳性.X-gluc染色表明,少部分愈伤组织出现肉眼可见的蓝色晕斑,说明GUS基因已经在小麦幼胚愈伤组织中表达.     

农杆菌介导玉米幼胚愈伤组织遗传转化体系的优化

以玉米骨干自交系‘郑58’的幼胚为材料,用农杆菌介导法对诱导培养出的胚性愈伤组织进行三价植物表达载体的遗传转化,同时对影响转化效率的主要因素进行研究.结果表明,当浸染液和共培养培养基中乙酰丁香酮(AS)的浓度为150mg·L-1时,抗性愈伤组织获得率显著提高17.39%;在菌液浓度D600为0.3、浸染时间为20min、共培养时间为60h、共培养温度为22℃、共培养培养基pH为5.4以及头孢霉素浓度为400mg·L-1的试验体系下,有利于提高玉米抗性愈伤组织的获得率,其获得率最高可达17.26%.     

直播稻金粳818成熟胚遗传转化体系的建立

[目的]建立高效的金粳818成熟胚遗传转化体系。[方法]以直播稻品种金粳818成熟胚为外植体,设计4种诱导培养基,筛选适合金粳818的诱导条件;设计5种分化培养基,筛选适合金粳818的分化条件;获得的愈伤组织用农杆菌介导法进行转基因再生。[结果]最佳诱导培养基为4.10 g/L NB+2 mg/L 2,4-D,诱导率为89.3%;最佳分化培养基为MS+5.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,分化率为81.1%,成苗率为52.1%;经PCR分子检测,再生幼苗100%为转基因阳性植株。[结论]该研究建立了金粳818成熟胚遗传转化体系,为品种定向改良奠定了技术基础。     

农杆菌介导的冷诱导基因水稻遗传转化体系的建立

利用农杆菌介导技术,以Bar基因为筛选标记,用高山离子芥的冷诱导基因Cbcor15a侵染水稻品种日本晴的愈伤组织,经分化诱导后获得了再生植株。经Cef和PPT筛选,共获得转化Cbcor15a基因的日本晴再生苗9株;经PCR检测和Basta涂抹实验,结果证明有6株再生苗呈阳性。本遗传转化体系的建立可为利用转Cbcor15a基因选育具有耐冷性的水稻新品种提供参考。     

玉米自交系幼胚培养体系的建立

以重庆地区常用的8个玉米自交系幼胚为外植体,研究不同基因型和培养基对玉米幼胚愈伤组织诱导率的影响.结果表明:自交系082在N6B5培养基的愈伤诱导率最高,达到98%,Hy04未诱导出愈伤组织,不同基因型愈伤诱导率的差异具有高度统计学意义.海09042在G1继代培养基的胚性愈伤组织呈颗粒状分散、结构松软、淡黄色,愈伤接种在加KT或加NAA的分化培养基中,以加NAA的绿苗数多.     

Optimization of Agrobacterium tumefaciens-Mediated Immature Embryo Transformation System and Transformation of Glyphosate-Resistant Gene 2mG2-EPSPS in Maize (Zea mays L.)

Since maize is one of the most important cereal crops in the world, establishment of an efficient genetic transformation system is critical for its improvement. In the current study, several elite corn lines were tested for suitability of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation by using immature embryos as explants. Infection ability and efficiency of transformation of A. tumefaciens sp. strains EHA105 and LBA4404, different heat treatment times of immature embryos before infection, influence of L-cysteine addition in co-cultivation medium after transformation, and how different ways of selection and cultivation influence the efficiency of transformation were compared. Glyphosate-resistant gene 2mG2-EPSPS was transformed into several typical maize genotypes including 78599, Zong 31 and BA, under the optimum conditions. Results showed that the hypervirulent Agrobacterium tumefaciens sp. strain EHA105 was more infectious than LBA4404. Inclusion of L-cysteine (100 mg L^?1) in co-cultivation medium, and heating of the immature embryos for 3 min prior to infection led to a significant increase in the transformation efficiency. Growth in resting medium for 4-10 d and delaying selection was beneficial to the survival of resistant calli. During induction of germination, adding a high concentration of 6-BA (5 mg L^?1) and a low concentration of 2,4-D (0.2 mg L^?1) to regeneration medium significantly enhanced germination percentage. Using the optimized transformation procedure, more than 800 transgenic plants were obtained from 78599, Zong 31 and BA. By spraying herbicide glyphosate on leaves of transgenic lines, we identified 66 primary glyphosate-resistant plants. The transformation efficiency was 8.2%. PCR and Southern-blot analyses confirmed the integration of the transgenes in the maize genome.     

普通小麦新品种陕农33未成熟胚高频再生体系的建立

陕农33是2012年审定的一个高产、稳产、强筋优质的小麦优良新品种。为了解陕农33组织培养特性,以科农199、H261为对照,研究陕农33未成熟胚愈伤组织的诱导和分化能力以及AgNO3、CuSO4对其组织培养的影响。结果表明:陕农33未成熟胚愈伤组织诱导率为98.11%、褐化率为2.48%、再生分化率为80.23%。差异显著性分析显示:陕农33与对照科农199(诱导率99.43%、褐化率2.25%、分化率71.18%)没有显著性差异(P0.05),但显著(P0.05)高于H261(诱导率96.24%、褐化率7.81%、分化率62.24%);说明陕农33具有较好的组织再生能力。另外,在培养基中添加4.0mg/L的AgNO3可以进一步提高愈伤组织诱导率至99.41%、分化率至82.35%,使褐化率降至1.68%;添加2.50mg/L的CuSO4可以提高绿苗分化率至84.17%。     

宁夏水稻成熟胚离体再生体系的建立

以34个宁夏粳稻品种的成熟胚为材料,N6和MS为基本培养基,研究了基因型、激素、分化,继代对宁夏粳稻成熟胚培养特性的影响.结果表明,基因型对宁夏粳稻成熟胚培养的影响较大,参试材料中优育28的培养特性最好;诱导愈伤组织中2,4-D质量浓度以2 mg/L较好;分化培养中参试品种均表现为KT 2mg/L+NAA 1 mg/L+IAA 0.5 mg/L处理的分化效果最好;成熟胚诱导的愈伤组织继代1～2次对分化没有显著的影响,继代3次以上,其分化能力明显减弱.通过本研究,初步建立了宁夏水稻成熟胚高频再生体系.     

胚龄对小麦盾片组织培养的影响

研究了播种时间、取材时间和盾片大小对小麦愈伤组织诱导、器官分化和植株再生的影响。结果表明,元月初播种的材料具备很好的盾片组织培养效果,生根和绿点率都可达100%,植株再生频率平均为46％,开花后第16d取材,生根和绿点率都达100％,植株再生频率平均达80％,达到最佳组织培养效果的的盾片大小为0．15～0.20cm。     

甘蓝基因转化中对农杆菌过敏反应控制因素的研究

农杆菌介导,将外源基因导入植物,是获得转基因植株的有效方法.在甘蓝转基因中,与农杆菌共培养后,外植体褐化(即过敏反应)严重影响着转化的成功率与效率.本试验采取共培养前预培养、降低农杆菌菌液浓度、缩短材料在菌液中处理时间以及在培养基中加入AgNO3、琼脂糖等附加物的措施,以期减轻褐化现象,提高抗虫基因转化的成功率.     

农杆菌介导的籼稻科恢675快速遗传转化体系的建立

本研究以籼稻科恢675成熟种子为材料进行了农杆菌介导的ThIPK2基因遗传转化。结果显示:持续高温光照培养使得愈伤诱导和继代只需10～14 d,有效缩短了愈伤获得周期,且愈伤诱导率可达95.6%。抗性愈伤率为10.6%,持续高温光照培养使得抗性愈伤继代5～7 d就可大量繁殖,且抗性愈伤分化率达48.8%。经第一次继代后的愈伤转化效率显著高于未经继代的愈伤的转化效率。因此,此转化系统有效缩短了水稻转化周期,优化了籼稻遗传转化,同时为抗逆基因转入籼稻提供了参考。