高效诱导子的制备方法及诱导成分研究

为了筛选大肠杆菌高效诱导子的制备方法,拟通过不同的物理、化学、生物方法破碎菌体获得诱导子,测定诱导子还原糖含量,在链霉菌702发酵过程中添加诱导子并测定农抗702的效价,采用有机溶剂萃取分离法对诱导子的主要作用成分进行初步分析。结果表明,研磨法与冻融法结合使用,诱导子的含糖量为1.46 mg/m L,比对照提高了245.15%;溶菌酶含量为0.8 mg/m L,保温时间为24 h时所得诱导子诱导链霉菌702产农抗702的量为380.88μg/m L,比对照提高了39.70%,差异显著;大肠杆菌诱导子中的多糖、蛋白质以及一些非蛋白、非多糖类的小分子物质对农抗702的合成具有诱导作用,并且其极性与乙酸乙酯相近。     

促进链霉菌702产生农抗702的诱导子筛选研究

通过分别添加非生物诱导子、生物诱导子对链霉菌702菌株进行诱导,考查诱导子对菌株合成农抗702的促进作用。结果表明,在培养32和64 h时,往链霉菌702培养物中分别加入苏氨酸和山梨醇的促进作用较明显,其中,添加苏氨酸的发酵液农抗702的抑菌圈直径比对照提高了30.25%。黑曲霉、桔青霉制备的诱导子作用不明显,而金黄色葡萄球菌制备的诱导子在培养64和96 h时添加都有促进作用,在64 h时添加效果最佳。枯草芽孢杆菌制备的诱导物只在64 h时添加抑菌效果较明显。大肠埃希菌制备的诱导子分别在培养0、32、64及96 h时添加至培养物中均能促进农抗702的产生,且在32 h时添加达到最佳状态,抑菌圈直径比对照提高了39.67%。苏氨酸和大肠埃希菌的最适添加浓度分别为50和3 μg·mL-1,其发酵产物抑菌圈直径分别比对照增加了25.78%和51.17%。     

农抗702诱导水稻抗瘟性研究

为探讨农抗702诱导水稻抗瘟性,分别采用稻瘟病易感水稻品种陆两优996和农抗702为试验材料,首先在水稻3叶1心时,将不同浓度的供试农抗702分别进行喷施,进行诱导水稻抗瘟性作用最佳浓度的筛选;然后在水稻7个不同生长发育期进行喷施药液,进行诱导抗瘟性的水稻最佳生长期和抗瘟性持续时间的测定。各试验处理喷施药液后4 d后分别接种稻瘟病菌孢子液,7 d后分别调查不同试验处理的病情指数和发病率及诱抗效果。结果表明:供试6种不同浓度的农抗702均能诱导水稻产生抗瘟性,且抗瘟性作用的较佳浓度为15μg/m L;在水稻7个不同生长发育期分别喷施浓度为15μg/m L的农抗702,均能诱导水稻抗瘟性,诱导抗瘟性较佳生长期为水稻3叶1心期,其诱抗效果达到56.56%;且水稻抗瘟性作用最佳时期为喷施后48~96 h,其诱导水稻抗瘟性的持续时间超过144 h。研究为农抗702进一步研发和防治水稻稻瘟病方法的应用提供有益的试验数据。     

链霉菌702产抑真菌物质发酵培养基优化及动力学研究

用响应面分析方法对链霉菌702产抑真菌物质发酵培养基成分进行了优化研究,并对优化后链霉菌发酵动力学进行了分析。通过优化得到玉米淀粉和蛋白胨的最适浓度分别为16.83 g/L、8.64 g/L,在优化后的培养基中链霉菌702产抑真菌物质效价达到1214.52μg/ml,比优化前789.41μg/ml提高了53.85%。动力学分析表明,所选动力学模型能较好地反映链霉菌702合成抑真菌物质的发酵过程,链霉菌702发酵产抑真菌物质过程属于部分偶联型。     

新型多烯大环内酯抗生素农抗702对水稻5种防御酶活性的影响

探索新型多烯大环内酯抗生素农抗702对水稻病原真菌的防病作用机理。在水稻4~5叶期分别喷施5种不同浓度的农抗702,以喷施浓度为125μg/mL的井冈霉素药液为阳性对照,以蒸馏水为阴性对照。喷施后分别取0、1、3、5、7、9 d水稻叶片进行5种防御酶的提取和活性测定。结果表明,分别喷施浓度为75、100、125、150、175μg/mL的农抗702和浓度为125μg/mL的井冈霉素药液,其水稻叶片内SOD、POD、PPO、CAT和PAL等5种防御酶活显著高于阴性对照;在0~9 d,喷施浓度为125μg/mL的农抗702水稻叶片的5种酶活性达到或超过浓度为125μg/mL井冈霉素喷施效果。可见,农抗702能诱导水稻植株的抗病性。本结果为进一步深入研究农抗702对水稻病原真菌的防病抗病作用机理提供了理论参考。     

农抗702诱导水稻抗瘟性对水稻丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

在水稻品种陆两优996三叶一心时,分别喷施15μg/m L农抗702、15μg/m L井冈霉素、蒸馏水,在喷雾48 h后接种稻瘟病菌,以只喷蒸馏水、不接种稻瘟病菌为空白对照,研究了农抗702诱导抗瘟性对水稻丙二醛(MDA)含量及5种抗氧化酶活性的影响。研究结果表明:与空白对照相比,农抗702处理、井冈霉素处理和只接种稻瘟病菌处理的水稻叶片中MDA含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均有所提高,其中农抗702处理的水稻MDA含量以及SOD、CAT和POD活性在早期显著高于只接种稻瘟病菌处理的,且APX和LOX活性上升速度及峰值高度也均高于后者的;农抗702处理的诱导抗瘟性效果能够达到或超过井冈霉素处理的。     

农抗702诱导水稻抗瘟性对水稻丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

在水稻品种陆两优996三叶一心时,分别喷施15μg/m L农抗702、15μg/m L井冈霉素、蒸馏水,在喷雾48 h后接种稻瘟病菌,以只喷蒸馏水、不接种稻瘟病菌为空白对照,研究了农抗702诱导抗瘟性对水稻丙二醛(MDA)含量及5种抗氧化酶活性的影响。研究结果表明:与空白对照相比,农抗702处理、井冈霉素处理和只接种稻瘟病菌处理的水稻叶片中MDA含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、脂氧合酶(LOX)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均有所提高,其中农抗702处理的水稻MDA含量以及SOD、CAT和POD活性在早期显著高于只接种稻瘟病菌处理的,且APX和LOX活性上升速度及峰值高度也均高于后者的;农抗702处理的诱导抗瘟性效果能够达到或超过井冈霉素处理的。     

链霉菌702发酵液对草莓保鲜作用的研究

采用链霉菌702发酵液对草莓的防腐保鲜效果进行了研究。通过测定不同处理草莓的含糖量、Vc变化和腐烂指数及重要的贮藏外观表明，链霉菌702发酵酒精浸提稀释50倍液和250mg／L纳他霉素处理的草莓的糖降解进度减缓，Vc含量维持较高含量，腐烂指数明显低于对照．且链霉菌702发酵液处理优于250mg／L纳他霉素处理。试验结果表明，链霉菌702发酵液对草莓有较好的保鲜效果，可有效的降低微生物的生长。     

链霉菌702对水稻种子萌发、幼苗生长及土壤微生物的影响

土壤微生物及其代谢产物往往会对作物生长产生影响。以春光1号水稻为供试种子,链霉菌702及其代谢产物为供试菌和抗生素,通过盆栽试验研究链霉菌702及其代谢产物农抗702对水稻种子萌发、秧苗素质和土壤微生物区系影响。结果表明,低浓度农抗702促进水稻种子萌发、胚根和芽的生长,根系活力提高,但含糖量下降;种子中的淀粉酶活性、蛋白质含量随农抗702浓度的升高先升后降。施加链霉菌702菌剂后土壤细菌和霉菌数量均有所减少,放线菌数量增加,硝化细菌和亚硝化细菌减少,好气性纤维素分解菌增加,土壤微生物不同生理类群的变化,加速了土壤养分循环,增强了水稻的养分吸收,从而促进水稻生长。     

响应面法优化链霉菌702产抑真菌物质生料发酵培养基

用响应面分析方法对链霉菌702产抑真菌物质生料发酵培养基进行了研究。实验首先利用部分重复因子试验筛选出链霉菌702发酵产抑真菌物质的关键因素为玉米淀粉和蛋白胨,其次利用最陡爬坡试验逼近最大响应区,最后利用中心组合设计及响应曲面分析确定关键因素的最佳浓度。通过优化得到玉米淀粉和蛋白胨的最适浓度分别为16.83 g/L、8.64 g/L,在优化后的培养基中链霉菌702产抑真菌物质效价达到1 214.52μg/mL,比优化前789.41μg/mL提高了53.85%。     

农抗702抗真菌活性的测定

探索农抗702的抗真菌活性.通过以农抗702为供试材料,霉菌、酵母菌以及14种植物病原真菌为供试菌,采用菌丝生长速率法和菌丝干重法测定农抗702对各种供试菌的抑制作用.结果表明农抗702对黑曲霉、青霉、毛霉、根霉、木霉、啤酒酵母、产朊假丝酵母、稻纹枯病、稻瘟病和稻曲病的最低抑菌浓度(mg/L)分别为3.3、6.5、6.5、3.3、3.3、6.5、3.3、23.8、59.64、475.4.农抗702对供试植物病原真菌的EC_(50)(mg/L)和EC_(90)(mg/L)依次是:油菜菌核病菌为0.23和1.95,葡萄炭疽病菌为0.27和2.91,车前草穗枯病菌为0.33和8.58,烟草赤星病菌为0.89和12.02,车前草菌核病菌为1.23和4.02,小麦赤霉病菌为1.40和7.38,棉花黄萎病菌为1.53和5.07,富贵竹炭疽病菌为1.73和5.61,水稻纹枯病菌为1.89和7.03,紫荆炭疽病菌为3.21和14.17,辣椒根腐病菌为3.40和20.78,交链孢病菌为4.13和22.01,稻瘟病菌为12.51和29.36,稻曲病菌为59.42和201.80.研究表明农抗702具有较强的抗真菌活性,为农抗702的应用提供有益的试验证据.     

链霉菌702生物活性物质抑菌的致死浓度和致死时间的测定

通过对链霉菌702所产生物活性物质和纳他霉素及Nisin分别对黑曲霉、青霉、绿色木霉、枯草芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、产朊假丝酵母、啤酒酵母的抑制作用研究,试验结果得出链霉菌702所产生物活性物质对各种指示菌的半致死浓度和半致死时间,证明链霉菌702所产生物活性物质抑制效果比纳他霉素及Nisin强。试验结果为链霉菌702所产活性物质应用提供了有益的试验数据。     

链霉菌702发酵液对水果的防腐保鲜作用初探

对链霉菌702发酵液对苹果、梨、猕猴桃、甜瓜的防腐保鲜作用进行了研究。通过测定不同处理的失重率及观察水果的贮藏外观表明,链霉菌702发酵液的酒精浸提稀释100倍液与10mg／L纳他霉素能减慢水果的水分蒸发,抑制有害菌生长,对水果有较好的防腐保鲜效果。     

链霉菌N2粗提物对水稻抗性相关生理因子的影响

为探明新型抗真菌活性物质农抗N2粗提物诱导水稻幼苗增强抗性的生理机制,开发绿色高效的生物农药,用不同浓度农抗N2粗提物处理水稻,测定了农抗N2粗提物防治水稻纹枯病的能力,及其对水稻抗性相关生理因子的影响。结果发现,经2.88,5.77,11.53μg/m L农抗N2粗提物处理后,离体水稻叶片的病情指数相比CK组分别降低了33.34%、41.67%和50%,有效地阻止了纹枯病菌侵染活体水稻植株。此外,适宜浓度的农抗N2粗提物不仅能激活水稻幼苗体内SOD、CAT和POD等抗氧化酶活,有效清除活性氧含量,而且能显著增强PPO和PAL相关酚类物质代谢酶的活性,增加总酚的积累,尤以1.44μg/m L效果最佳;同时,农抗N2粗提物能促进可溶性总蛋白、几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶相关病程蛋白的产生,且于48 h左右达最大值,由此水稻幼苗的抗病害能力得到显著提升。该研究结果为揭示生防Streptomyces sp.N2的生防机理及应用提供了有力的科学依据。     

大鼠甘油醛3 磷酸脱氢酶的原核表达、纯化及其酶活动态监测

利用大肠杆菌原核表达系统高效表达大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,并结合蛋白分离纯化技术获得高纯度样品,动态监测其酶活。通过RT-PCR技术,扩增PC12细胞中甘油醛3-磷酸脱氢酶编码序列并亚克隆到原核表达载体pET28b;鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞并采用诱导剂IPTG(终浓度1mmol/L)诱导表达,表达产物采用15% SDS-PAGE鉴定,用镍柱对蛋白进行纯化及脱盐;最后将分离纯化产物在体外进行甘油醛3-磷酸脱氢酶酶活动态分析。结果表明,成功构建大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶的原核表达载体pET28b-G3PDH;高效表达甘油醛3-磷酸脱氢酶,表达产物占总蛋白35%,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清;制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活动态扫描显示其具有高效酶活性。通过大肠杆菌原核表达技术高效制备具有重要酶活作用的大鼠甘油醛3-磷酸脱氢酶,为进一步研究其在糖代谢中的功能以及其可能的新功能奠定基础。     

壳聚糖诱导下浅玫瑰色链霉菌菌体蛋白差异表达分析

建立了有效分析浅玫瑰色链霉菌菌体全蛋白质的方法,使用分离范围为p H 4~7的IPG胶条、2D clean-up试剂盒法纯化方法、80μg蛋白质上样量和银染的双向电泳技术,获得了低背景、高分辨率和重复率、无明显条纹的浅玫瑰色链霉菌全蛋白质双向电泳图谱。通过Image Master2D Platinum7.0软件对壳聚糖诱导条件下浅玫瑰色链霉菌菌体总蛋白质的电泳图谱进行匹配分析,在诱导菌株图谱上有723±14个清晰可见的蛋白质点可供差异分析。与未诱导菌株的双向电泳图谱对比结果显示:18个蛋白质点在诱导菌株中差异表达,其中14个蛋白质点的表达量上调,4个蛋白质点的表达量下调,选取10个差异表达量在5倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定,结果显示,延长因子Tu、RNA聚合酶、分子伴侣等蛋白在壳聚糖诱导下表达量增加,表明它们在浅玫瑰色链霉菌代谢壳聚糖的过程中起重要作用。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶在里氏木霉中的分泌表达及其对内源纤维素酶表达的影响

目前饲料工业中所使用的纤维素酶和葡萄糖氧化酶来自不同的表达系统,其生产成本较高;而在同一种微生物宿主中同时表达这两种重要的饲料工业用酶则有可能会降低成本。根据里氏木霉中密码子的偏好性优化黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶基因god,并利用DNA assembler方法构建pRS424-cbh1P-god-cbh1T质粒(p PGT质粒);通过PEG介导的原生质体转化法,将其转入里氏木霉Tu-6Δtku70尿嘧啶缺陷型菌株中,经筛选得到葡萄糖氧化酶酶活较高的一株转化子(2号),SDS-PAGE分析显示重组GOD的蛋白分子量大小约为70 k Da,进一步使用质谱确证了GOD得到成功表达。摇瓶发酵表明,2号转化子在微晶纤维素诱导92 h后,GOD酶活达到4.63 U/m L。该转化子的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和外切纤维素酶活分别为7.88 U/m L、2.58U/m L和0.84 U/m L,而出发菌株分别为6.79 U/m L、3.19 U/m L和0.57 U/m L,而β-葡萄糖苷酶由原来的0.66U/m L提高到1.65 U/m L(1.5倍)。实验表明,在里氏木霉中表达GOD能显著提高β-葡萄糖苷酶的酶活,也能使总体纤维素酶活得到提高。     

水分胁迫对甘蔗根系蛋白质差异表达的影响

从蛋白质角度对水分胁迫下甘蔗苗期根系蛋白质SDS-PAGE电泳图谱的变化进行研究,以揭示水分胁迫下甘蔗苗期根系蛋白质的表达差异。甘蔗品种新台糖16号砂培育苗至苗期茎高约25 cm进行处理,将幼苗根系放入含100 g/L聚乙二醇6000的Hoagland营养液中进行模拟干旱胁迫处理,处理不同时间段采取根样品,SDS-PAGE电泳分析法探讨水分胁迫对供试甘蔗品种根系蛋白质变化与水分胁迫强度的关系。与对照相比,在水分胁迫处理的24 h内,稳定出现的新诱导合成蛋白条带分子量为14.2KDa蛋白;对胁迫响应最快的是81.7和52.6 KDa蛋白条带,胁迫开始2 h就显著下调;而33.8 KDa蛋白条带在胁迫后相当长时间保持稳定,后期才显著上调;60.3、26.1、16.2 KDa蛋白条带胁迫后期变化活跃;PEG胁迫5 h处理蛋白质条带变化最大,既有新增蛋白条带(88.7、65.9、31.9、14.2 KDa)与消失蛋白条带(64.9 KDa),又有上调表达蛋白条带(60.3 KDa)与下调表达蛋白条带(81.7、52.6、26.1 KDa)。甘蔗根系蛋白质在响应PEG胁迫的基因表达调控中扮演重要角色,上述蛋白条带的变化可能与甘蔗水分胁迫密切相关。     

新农抗702对水稻抗纹枯病诱导抗性的初步研究

为研究新农抗702对水稻的抗性诱导机制,用新农抗702处理水稻叶片,叶片表现较明显的抗纹枯病作用;用不同质量浓度新农抗702在不同时间下诱导稻苗,测定稻苗体内防御酶的变化,结果表明:质量浓度为1.5 μg/mL,处理12 h时,过氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)、苯内氨酸解氨酶(PAL)、过氧化氢酶(CAT)的活性分别达到:16.58 U/(g· min)、160U/(g·s)、234.02 U/(g·min)、37.67 U/(g · min),酶活性较高,而新农抗702对超氧化物歧化酶(SOD)无显著的影响.     

菊酯类农药降解酶基因原核表达条件的优化

绘制了菊酯类农药降解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-est825的生长曲线,优化了诱导起始菌液浓度、诱导剂浓度、诱导温度及诱导时间等条件,得到该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌液OD600值为4时,添加终浓度为6g/L的乳糖,37℃诱导8h,酶的表达量最高,酶活为95U/mL,纯化后的重组酶分子量为30.1ku。