传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株，HZ96)VP2基因的质粒PBS为模板，根据其序列设计引物进行PCR扩增，得到1．5kb左右长的VP2基因产物；用Kpn Ⅰ和SalⅠ酶切纯化的PCR产物；将纯化的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301水稻胚乳特异性启动子GTl下游，并经PCR、酶切和测序鉴定．植物重组表达栽体经三亲交配已导入根癌农杆菌中．     

幼鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株 VP2基因的克隆和分析

利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR），扩增并克隆传染性法氏囊病病毒超强毒株（vvIBDV）SH9901 VP2基因，并对其进行全序列测定。结果表明，克隆到的VP2基因序列长1.3kb；强毒株SH9901 VP2片段与超强毒株OKMY高度相似；核苷酸与氨基酸同源性分别为99.26％，99.8％。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因植物表达载体的构建

以含鸡传染性法氏囊病病毒(杭州分离株,HZ96)VP2基因的质粒 PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.5 kb左右长的VP2基因产物;用KpnⅠ和 SalⅠ酶切纯化的PCR产物;将纯化的酶切产物在 T4 DNA连接酶的作用下定向克隆到植物表达载体Cambia1301 水稻胚乳特异性启动子GT1下游, 并经PCR、酶切和测序鉴定.植物重组表达载体经三亲交配已导入根癌农杆菌中.     

传染性法氏囊炎病毒部分VP2基因的克隆与原核表达

传染性法氏囊炎病毒(IBDV)是侵害雏鸡和青年鸡的重要病原,病毒VP2蛋白是主要保护性抗原。为研究不同毒株VP2基因的变异及其抗原表位特点,作者克隆、表达和鉴定了VP2基因。首先应用SPF鸡胚接种和鸡胚成纤维细胞培养法复制病毒,并以自行设计的1对引物,从中扩增出987 bp的VP2片段并进行鉴定。测序结果表明,国内不同毒株VP2高变区序列同源性达99%以上。将其部分片段插入载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转入大肠杆菌后用IPTG诱导表达。经检测,在SDS-PAGE中可见大小为44 400的融合蛋白。     

鸡传染性法氏囊病病毒河南分离株HeYD VP2基因高变区基因克隆及序列分析

为初步确定新分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)河南株HeYD的毒力,根据GenBank数据库中已报道的IBDV基因组序列,设计合成了1对VP2基因高变区特异性引物,应用RT-PCR方法对分离自河南省某发病鸡场的IBDV野毒株HeYD的VP2基因高变区进行了基因克隆及序列分析,并与其他参考毒株高变区进行了序列比对,序列...     

火鸡传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆和序列比较

参考GenBank发表的传染性法氏囊病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对特异扩增IB-DVVP2基因的引物。以广西玉林发病火鸡群分离的IBDV野毒YL株为材料,以其基因组为模板利用RT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于PUC119质粒上,得到重组PUC119质粒。并对VP2基因全序列测定、分析和聚类表明,YL株与欧洲超强毒株非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其疫苗的研究进展

传染性法氏囊病病毒(IBDV)是鸡传染性法氏囊病(IBD)的病原。近年来IBDV变异毒株和超强毒株的流行,严重威胁着世界养鸡业的发展,传统疫苗已不能控制IBDV的流行,迫切需要研制新型疫苗。IBDV VP2蛋白是重要的结构蛋白,能诱导机体产生中和抗体,因此,利用VP2蛋白制备IBDV重组疫苗成为国内外研究的热点。综述了IBDV VP2蛋白的作用及在不同表达系统中用VP2蛋白制备疫苗的研究进展,以期为IBDV新型疫苗的开发提供参考。     

传染性法氏囊病病毒VP5蛋白跨膜区的敲除及可溶性原核表达研究

[目的]构建敲除传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5蛋白跨膜区序列的原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、分离和纯化。[方法]利用PCR技术分别扩增IBDVVP5基因的胞外片段和胞内片段,然后将2个片段及pET-28b（＋）同时相接,即载体一胞内片段一胞外片段一载体,构建了敲除跨膜区基因片段的VP5重组表达质粒pET—VP5-FC及改进后的pET—VP5-SC。将表达质粒转化BL21（DE3）,IPrG诱导后经Ni亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组蛋白。[结果]得到可溶性表达的IBDVVP5。[结论]为进一步研究VP5蛋白的结构与功能奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病毒BJ 10株分离鉴定及其VP2基因序列分析

分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV),并对其VP2基因进行序列分析。从陕西宝鸡地区疑似疫情的鸡群分离到1株IBDV（命名为BJ 10株）,应用血清学琼脂凝胶免疫扩散试验(agar gel immunodiffusion test, AGID),结果在抗原孔和血清孔间可见明显的白色沉淀线。通过RT PCR扩增VP2基因高变区并对其进行生物信息学分析,结果表明,BJ 10株与超强毒株中国香港HK46的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.7%和 99.6%,且高变区特征性氨基酸的变化与超强毒株完全一致,表明BJ 10株属于超强毒株,与香港地区的vvIBDV分离株有较为密切的亲缘关系。     

鸡白细胞介素2口服免疫佐剂增强传染性法氏囊病病毒DNA疫苗免疫效果的研究

将含萧山鸡白细胞介素2基因的真核表达质粒pCI-IL-2的减毒鼠伤寒沙门氏茵ZJ111(ZJ111/pCI-IL-2)口服接种小鼠和雏鸡,并与传染性法氏囊病病毒(IBDV)DNA疫苗联合免疫雏鸡观察其免疫效力.结果表明:利用减毒沙门氏菌作为栽体的鸡白细胞介素2口服免疫增强剂具有相对的安全性,重组ZJ111/pCI-IL-2茵能明显增强IBDV DNA疫苗对强毒株攻击保护率;增强IBDV DNA疫苗诱导的抗体的效价(P＜0.05);增强IBDV DNA疫苗所诱导的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),上述结果初步表明以减毒沙门氏菌为载体的白细胞介素2免疫增强剂具有良好的安全性和免疫增强作用,为研制低成本、实用化的禽类口服免疫增强剂奠定了基础.     

传染性囊病病毒结构蛋白VP2的融合表达

将IBDV超强毒株HK46的结构蛋白vp2基因的cDNA片段插入表达质粒psoc的EcoRI位点,获得重组质粒pSOC-VP2．用pSOC-VP2转化E．coli BL21(DE3),获得表达VP2蛋白的工程菌BL-SOC-VP2．在1μG/mL IFIG诱导之下,BL-SOC-VP2表达了融合蛋白SOC-VP2,其相对分子质量为49000．SDS-PAGE检测表明,融合蛋白SOC-VP2的最大表达量为细菌总量的14．35％．ELISA分析表明,大肠杆菌表达的SOC-VP2能与IBDV阳性血清发生特异性反应．     

Oral administration of Allium sativum extract protects against infectious bursal disease in chickens

Garlic (Allium sativum, Liliaceae) has been safely used for more than 5000 years, and research on garlic extract is rapidly increasing because of its multiple biological functions. The in vivo effects of oral administration of garlic mixture (GM, water-soluble extract) on infectious bursal disease virus (IBDV)-infected specific pathogen free male white leghorn chicken were examined through histopathological, immunohistochemical, and Western blot analyses, and enzyme-linked immunosorbent assay. The results confirmed the protective effects of oral administration of 5 mg·kg⁻¹ BW GM (Group GM1) on bursal lesions after IBDV infection. In particular, protein expression of IBDV in the bursa decreased in Group GM1, indicating that GM administration decreased IBDV replication in the bursa. Furthermore, immunoglobulin M- and A-bearing B lymphocytes significantly increased 7 days post infection in bursae in Group GM1 (P<0.01), suggesting that the oral administration of 5 mg·kg⁻¹ GM offers moderate protection against B cell destruction after IBDV infection. During infection, the concentration of bursal interferon gamma (IFN-g) increased and peaked in Group GM1 earlier than in Group T (IBDV-exposed), demonstrating that GM administration prompted the production of IFN-g to protect against IBDV infection.     

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

    为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200 μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P＜0.05).     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.     

Analysis of the function of D279N mutation of VP2 of infectious bursal disease virus

Infectious bursal disease virus(IBDV)is responsible for the highly contagious infectious bursal disease of chickens.Further understanding the gene-function is necessary to design the tailored vaccine.The amino acid residue 279,located on strand P_F of VP2,is one of the three residues that have been reported to be involved in cell-tropism but with some inconsistency.In this study,to further clarify the amino acids involved in the cell tropism of IBDV,a series of mutations about residue 279were introduced into the VP2 of vv IBDV Gx strain.With the reverse genetic system,we found single mutation of D279N,double mutations of D279N/A284T or Q253H/D279N were not enough to adapt IBDV to chicken embryo fibroblast(CEF)cell.To evaluate whether residue 279 could influence the replication and virulence of IBDV,the virus r Gx HT-279 with three mutations(Q253H/D279N/A284T)was rescued and evaluated.Results showed that the mutation of residue 279 in VP2had no efficient effects on both the replication efficiency in vitro and the virulence to SPF chickens of IBDV.In summary,the results demonstrated that residue 279 of VP2 did not contribute efficiently to cell tropism,replication efficiency,and virulence of IBDV at least in some strains.These findings provided further information for understanding the gene function of IBDV.     

山羊PTHrP基因CDs区克隆及其融合蛋白的表达

【目的】克隆山羊甲状旁腺相关肽(Parathyroid hormone related protein,PTHrP)基因,并进行原核表达,获得具有生物学活性的融合蛋白。【方法】无菌采集山羊乳腺组织,采用TRIZOL法提取总RNA,RT-PCR克隆山羊PTHrP基因全CDs区。将山羊PTHrP基因全CDs区插入pET-32a(+)表达质粒构建pET-PTHrP质粒,经酶切和测序鉴定后,将其转化E.coliBL21(DE3)菌株,经2mmol/LIPTG、37℃诱导表达8h后,进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。【结果】获得了山羊PTHrP基因全CDs区,长534bp(GenBank登录号GU573787);酶切和测序显示,原核表达载体pET-PTHrP构建成功;SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,在E.coliBL21(DE3)中成功诱导表达了pET-PTHrP融合蛋白。【结论】克隆了山羊PTHrP基因,获得了PTHrP融合蛋白。     

IBDV VP2/4/3-ChIL-2融合基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中的表达

构建含有传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)VP2/4/3和鸡白细胞介素2(Chicken Interleukin 2,ChIL-2)融合基因的真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,并在Vero细胞中进行表达.应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension),分别经3次PCR获得融合基因片段VP2/4/3-IL-2、IL-2-VP2/4/3,定向插入真核表达载体pCI中,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3,在脂质体介导下,分别转染Vero细胞.RT-PCR检测证实导入的外源基因在Vero细胞中得到了转录;间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot检测证实重组质粒在Vero细胞中正确表达了插入的外源基因编码的融合蛋白,且表达的融合蛋白具有免疫反应性.重组真核表达载体pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3的成功构建及其在Vero细胞中的有效表达,为进一步探讨ChIL-2作为分子免疫佐剂对IBDV DNA疫苗的特异性免疫增强作用奠定了基础.