水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)原生质体制备与再生技术及优化

水稻纹枯病的病原菌是立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn),其病原菌(R.solani Kühn)又称为水稻纹枯病(rice sheath blight)菌,由立枯丝核菌侵染引起的水稻纹枯病是水稻上最重要的病害之一。为建立高效的水稻纹枯病菌原生质体制备技术体系,采用0.7mol/L NaCl作为渗透稳定剂,对Glucanex、溶壁酶(lywallzyme)、纤维素酶(cellulase-R-10)、离析酶(macerozyme-R-10)、蜗牛酶(snailase)、崩溃酶(driselase)和裂解酶(lysing enzyme)等7种不同的胞壁裂解酶降解水稻纹枯病菌GD-118菌株细胞壁的作用进行测定,并对不同酶组合及其酶质量浓度进行优化筛选。结果显示:Glucanex对水稻纹枯病菌细胞壁的降解效果最好,用20mg/mL Glucanex处理1g菌丝4h后,可释放118.5×104个原生质体;用15mg/mL Glucanex和10mg/mL lywallzyme混合酶处理,可高效降解水稻纹枯病菌细胞壁并获得大量原生质体,原生质体产量达3.09×107个/g菌丝,再生率达58%;Glucanex和lywallzyme的混合酶对不同水稻纹枯病菌菌株的细胞壁降解和原生质体释放没有显著差异。可见,上述制备水稻纹枯病菌原生质体的方法具有较好的高效性和适用性,可满足该菌分子遗传研究的需要。     

水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化

为获得进行水稻纹枯病菌遗传转化所需的高质量原生质体,选用该病菌强致病力菌株GD-118,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的水稻纹枯病菌原生质体制备的最佳条件组合是"纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶"组合酶、总酶终质量浓度10mg/mL、菌丝菌龄15h、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4.7H2O为渗透压稳定剂,此最佳条件组合所制备的原生质体产率高达4.00×107/g;原生质体最佳的再生条件是酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上26℃时进行培养,在此条件下可获得最佳的再生效果,再生率为39%。     

小麦纹枯病菌原生质体制备条件及再生菌株致病性研究

以小麦纹枯病菌HD-6为对象,进行原生质体制备与再生研究,并将再生菌株与原始菌株的致病性进行比较分析,为建立小麦纹枯病菌高效遗传转化体系提供依据.选用溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶、纤维素酶4种常见酶分别对小麦纹枯病菌进行酶解,并通过单因素试验分析酶解温度、酶解时间以及溶液pH值对原生质体得率的影响.结果表明,4种酶均能够裂解小麦纹枯病菌细胞壁得到一定数量的原生质体,其中崩溃酶的裂解效果最好,每克菌丝得到的原生质体数可达到2.6×108个.该酶的最佳反应温度是24℃,最适的酶解时间是3h,最适的pH值是6.0.获得的原生质体可以完成再生,并且再生菌株与原始菌株的致病力没有显著差异.     

稻瘟病菌原生质体的制备和再生菌株的致病性

以稻瘟病（Ｍａｇｎａｒｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）菌株ＺＡ４９、１３１为供试菌株,进行原生质体的制备试验。结果表明：用９种酶均能消化该菌细胞壁,并获得一定数量的原生质体;产生原生质体效率最高的是酶Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４和Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ,且这两种酶以１０ｍｇ／ｍｌ浓度产生的原生质体数量最多,消化２￣３ｈ后即可获得相当数量的原生质体,最适作用温度分别为３０℃和３２℃。以几丁质降解酶与Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４或Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ混且时对制备原生质体有很好的增效作用。作用认为,Ｎｏｖｏｚｙｍ ＾ＴＭ２３４和Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ的作用浓度以５ｍｇ／ｍｌ最为经济、实用。所制备的原生质体均能再生菌丝和具有产生与原菌株相同致病性分生孢子的能力。     

稻纹枯病菌,Rhizoctonia solani对井岗霉素胁迫抗性测定方法研究

１９９３年和１９９４年设置井岗霉素８个梯度浓度：３．１２５、６．２５、１２．５、２５．５０、１００、２００、４００ｐｐｍ，比较培养基液体，平皿固体和离体稻茎３种培养方式，探索纹枯病菌对井岗霉素胁迫抗性测定方法。     

烟管菌T1原生质体制备及菌丝再生条件优化

[目的]研究烟管菌T1(Bjerkandera adusta)原生质体制备及菌丝再生的最佳条件。[方法]研究菌龄、渗透压稳定剂种类和浓度、pH、酶浓度及酶解时间对原生质体得率的影响,并研究再生培养基种类对菌丝再生的影响。[结果]在PDA液体培养基中,以28℃摇床培养3 d的菌丝最适于该菌原生质体制备;用0.5 mol/L KCl配制的含有15 mg/m L的溶壁酶于30℃下酶解3 h,获得原产量最高,达1.18×10~6个/m L;RM1培养基再生率最高,达1.22%。[结论]该研究优化了原生质体制备及菌丝再生条件,为进一步研究烟管菌噬藻分子机制提供理论依据。     

1株降酚菌的原生质体制备和再生研究

为了优化组合降酚菌原生质体制备与再生的条件。以从合肥钢厂焦化废水处理池的活性污泥中驯化筛选得到1株高效降酚假单胞菌为材料,通过正交实验,探讨蔗糖浓度、溶菌酶浓度E、DTA浓度和酶解时间对该菌原生质体制备与再生的影响。原生质体制备与再生的最优条件:蔗糖浓度20%,溶菌酶浓度0.5 mg/ml,EDTA浓度0.2%,酶解时间40 min。在此条件下,它的菌株形成率为75.3%,再生率为7.8%。影响降酚假单胞菌原生质体形成率的因素顺序为蔗糖浓度>溶菌酶浓度>作用时间>EDTA浓度。     

红酵母原生质体制备和再生条件研究

［目的］初步探讨红酵母原生质体制备和再生的条件。［方法］以红酵母为试材,研究渗透压稳定剂pH值、酶浓度、酶解时间、预处理时间4个因素对红酵母原生质体制备率和再生率的影响。［结果］pH值在6.5～7.0,原生质体的制备率和再生率随着渗透压稳定剂pH值的升高而上升。当酶浓度从0.2%上升到1.0%时,原生质体制备率上升较快,而原生质体再生率下降较慢。随着酶解时间的增加,原生质体的制备率逐渐增加,而原生质体的再生率逐渐下降。在5～15 min,原生质体制备率和再生率均随着预处理的时间的增加而降低。［结论］当渗透压稳定剂pH值为7.0,蜗牛酶酶浓度为1.0%,酶解时间为60 min,预处理时间为5 min时,原生质体的制备率和再生率能分别达到较高的值。     

洛伐他汀产生菌土曲霉原生质体的制备与再生

报道了产生降血脂药物洛伐他汀（lovastatin)的土曲霉（Aspergillus terreus)的原生质体的制备与再生条件及原生质体形成过程,结果表明用溶壁酶5mg.mL^-1,Zymolyase 20T 2.5mg.mL^-1和蜗牛酶2．5mg.mL^-1配制的混合酶液,可制备出土曲霉生质体;其最佳酶解温度为34℃,作用5h,原生质体再生率达17％以上。     

桦褐孔菌原生质体制备与再生

采用正交设计方法对桦褐孔菌原生质体最佳制备与再生条件从酶条件、酶解时间、温度等5个方面进行了研究。试验结果表明:其原生质体制备最佳条件是以液体静置培养6d的菌丝体,0.6mol·L-1KCl作为渗透压稳定剂,在30g·L-1溶壁酶作用下,32℃酶解4h,制备率达2.675×107个·mL-1;再生最佳条件是液体静置培养10d的菌丝体,0.6mol·L-1NaCl为渗透压稳定剂,在30g·L-1溶壁酶作用下,32℃酶解2h,再生率为6.83%。     

水稻纹枯病菌毒素研究进展

对水稻纹枯病菌毒素的提纯方法、组分分析、毒害和致病机理等进行综述,并对研究前景进行展望.     

平菇原生质体制备及再生培养研究

平菇菌丝原生质体的释放以菌龄４～６ｄ的幼嫩菌丝,用２％Ｌｙｗａｌｚｙｍｅ采用０．６ＭＫＣｌ为渗稳剂在ｐＨ值为５．５、温度为３５℃、酶解２～２．５ｈ生长较好,可达１０７个／ｍＬ,孢子释放原生质体在１．５％溶壁酶和１．５％纤维素酶混合作用,同样外界条件下原生质体转化率可达１００％。原生质体再生以２号培养基在０．６Ｍ甘露醇的作用下,用载片悬浮滴式再生法,再生率可达１２．３％。     

尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型原生质体制备优化及再生性能

唐菖蒲(Gladiolus hybridus Hort)根腐病是由尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Gladioli)引起的真菌性病害。原生质体是研究尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型与唐菖蒲之间的互作关系的重要工具,试验以尖孢镰刀菌唐菖蒲专化型为供试菌株,进行原生质体制备条件的优化与再生,明确培养基、菌龄、β-巯基乙醇预处理、酶选择以及酶解时间对原生质体产生的影响。试验结果表明:在PDB培养基中原生质体制备的最优条件为15μLβ-巯基乙醇预处理1 h,在5%崩溃酶溶液酶解3 h。在此条件下,12~14 h菌丝的原生质体产量可达到1.4×107个/m L,再生率为57.4%。     

蛹虫草原生质体的制备和再生研究

研究了不同渗透压稳定剂、酶的种类及浓度、温度、pH、β-巯基乙醇预处理等条件对蛹虫草原生质体制备的影响,以及不同培养基对原生质体再生的影响。结果显示蛹虫草菌株原生质体的最佳制备和再生条件为:0.7 mol/L氯化钠作为渗透压稳定剂,纤维素酶5 mg/dL、蜗牛酶5 mg/dL、溶菌酶5 mg/dL、溶壁酶10μL混合酶解6 h,酶解温度为30℃,最佳pH 5,再生培养基为PDA(添加0.7 mol/L氯化钠)。     

动物肠道优势需氧菌原生质体制备与再生研究

从动物肠道优势需氧菌中筛选适于原生质体制备和再生的菌株,确定其原生质体制备与再生的最佳条件,为今后作为与厌氧菌原生质体融合的亲本奠定基础。研究发现,供试20株不同动物肠道优势需氧菌中,只有来自ICR小鼠肠道的M3,M4,M5和M6以及来自猪肠道的Z5对溶菌酶较为敏感。进一步研究发现,5株溶菌酶敏感菌株以来自ICR小鼠肠道的M6(即弗氏埃希氏菌株Escherichia fergusonii M6)原生质体制备率和再生率均最高。进而以菌株M6为试材,研究不同菌龄、酶浓度、酶解时间、渗透压稳定剂以及添加不同化学组分等对菌株M6原生质体制备与再生的影响。通过本研究确定的菌株M6原生质体制备与再生的最佳条件为:菌龄5h,溶菌酶浓度20mg/mL,脱壁时间45min,渗透压稳定剂为0.7mol/L山梨醇,向再生培养基中同时添加0.8%牛血清蛋白和0.1mol/L N-乙酰氨基葡萄糖,此时原生质体平均制备率与再生率分别为87.80%和85.42%。     

羊肚菌原生质体制备和再生

本文从菌丝培养、菌丝酶解、原生质体再生等方面研究了尖顶羊肚菌(M orchella conica)A401和粗腿羊肚菌(M.crassieps)一个菌株E903的原生质体制备与再生条件,结果表明:两供试菌种在20℃下于营养丰富的现配液体培养基③中匀速振荡培养2~4 d可得菌龄一致、活力强、量大的菌丝体,收集菌丝体洗涤吸干水分后在现配酶液①中于30℃恒温下振荡酶解3.5 h原生质体产量最高(A401为3.8×106个/100 mg.mL,E903为3.6×106个/100 mg.mL),再将分离纯化的原生质体悬液单层涂布到新鲜的③号再生平板上,20℃恒温培养3~5 d后可得大量再生菌落(最高再生率A401为0.78%,E903为0.8%)。     

鸡腿菇原生质体制备与再生研究

以鸡腿菇双核菌丝为材料,利用溶壁酶制备原生质体,采用单因素试验确定最佳条件。结果表明,原生质体产量最高的条件是取菌龄为5 d的液体静置培养的菌丝体,以0.6 mol/L蔗糖为渗稳剂,在酶解温度30℃、酶浓度20 g/L、菌丝量20 g/L的条件下酶解3 h,制备的原生质体量为2.5×107个/m L。将制备的原生质体稀释并涂布于再生培养基,再生率为10.9%,研究为鸡腿菇原生质体融合及优良品种选育提供研究基础。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

10种除草剂对水稻纹枯病菌的影响

在实验室条件下,就10种稻田除草剂对水稻纹枯病菌的影响进行研究。结果表明:在PSA培养基上,乙氧氟草醚、丁草胺、乙草胺、恶庚草烷和恶草灵能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝的生长,其IC50分别为2.01、4.16、8.12、11.97和22.01mg·L-1;而灭草松、苄嘧磺隆、环胺磺隆对菌丝生长抑制作用不明显。在100mg·L-1浓度下,乙氧氟草醚、乙草胺、恶庚草烷、恶草灵、丁草胺对水稻纹枯病菌菌核的萌发有一定的抑制作用。盆栽试验结果表明:二氯喹啉酸、乙氧氟草醚、恶草灵、丁草胺和恶庚草烷对水稻纹枯病的发生有抑制作用;而灭草松、苄嘧磺隆、乙草胺则有加重病害发生的趋势。