黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性。结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2×105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培养基组成为豆渣1%、米糠1%和Tween 800.1%,初始pH值5.5;菌株在发酵温度28℃、装液量50 mL(250 mL摇瓶)、摇床转速150 r/min的发酵条件下发酵120 h,发酵液酶活为(200±10)U/mL。所产β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的最适温度为55℃、最适pH值2.5、最佳水解时间15 min;在该条件下酶的表观米氏常数(Km)为1.35 g/L,最大水解速率(Vmax)为26.45 g/(L.min.mg),酶活半衰期为15 min,50℃时大于60 min;酶的水解活性受Na+、Ca2+的显著激活,受Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg+、Zn2+、Mn2+等离子(10 mmol/L)和葡萄糖、乙醇的抑制。     

黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究

采用硫酸铵盐析、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等步骤,从黑曲霉的发酵液中获得了凝胶电泳均一的两种β-葡萄糖苷酶。其中一种为耐高糖的β-葡萄糖苷酶,葡萄糖抑制系数(Ki)为41.01 mmol/L,纯化倍数和得率分别为56.7倍和22.66%。耐高糖β-葡萄糖苷酶单亚基分子质量为114.6 ku,以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物时,米氏常数(Km)值和酶促反应的最大速率(vmax)分别为0.904 mmol/L和1.08μmol/min。该酶最适反应温度60℃,最适反应pH值为4.0;在60℃以下及pH值3~7范围内均能保持稳定。所测定的化学试剂中,Ag 对酶具有较强的抑制作用,其它金属离子及乙二胺四乙酸对酶的活性影响不大。甲醇、正丁醇有明显激活酶活性的作用,但乙腈、丙酮对酶的抑制作用明显。     

β-葡萄糖苷酶的制备及在纤维素辅助水解上的应用研究

研究了固体发酵法制备β-葡萄糖苷酶及其在纤维素水解上的应用.黑曲霉NL02以玉米芯和麸皮为碳源固体发酵制备β-葡萄糖苷酶,培养5d,酶活力达到225.43IU/g(以干曲计).粗β-葡萄糖苷酶酶液经硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化,获得单一β-葡萄糖苷酶组分,酶活回收率和比活力分别为69.34%和133.88IU/mg.底物质量浓度为100g/L的稀硫酸预处理玉米秸秆,经酶用量为20FPIU/g(以纤维素计)的里氏木霉纤维素酶和4IU/g(以纤维素计)的β-葡萄糖苷酶水解48h,水解糖液中纤维二糖和葡萄糖质量浓度分别为1.12和42.68g/L,纤维素水解得率和可发酵性糖的比例分别为62.85%和97.44%.     

Penidiella sp.HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp.HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL).粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL.通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku.该酶反应的最适温度为6...     

Penidiella sp. HEY-1β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

通过Penidiella sp. HEY-1发酵豆渣可制备产胞外β-葡萄糖苷酶(BGL)。粗酶液经过乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的BGL。通过SDS-PAGE测得其分子质量为65.5 ku。该酶反应的最适温度为60~70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0~8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,而Na+对酶有抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。底物专一性实验表明,该酶可作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p-NPGlu)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-NPG)。作用于p-NPGlu和o-NPG的米氏常数(Km)值分别为0.434和0.411 mmol/L,酶促反应的最大速度(vmax)分别为1.0×10-3和3.3×10-4mol/(L.min)。     

-葡萄糖苷酶的研究

以壳聚糖微球为载体,采用吸附-交联法固定化β-葡萄糖苷酶。采用正交试验设计确定最佳固定化条件。β-葡萄糖苷酶的最佳固定化条件为:pH值5.0,酶用量48.6IU/g(以绝干壳聚糖计,下同)的β-葡萄糖苷酶经壳聚糖微球吸附12h后,在25℃、1.0%的戊二醛存在下交联2h,得到酶活力为41.76IU/g和酶活回收率为85.93%的固定化酶。     

β-木糖苷酶的研究进展

综述了β-木糖苷酶的性质、结构、催化机制和基因工程等方面的研究进展,并展望了该研究在能源工业、造纸工业和医药工业上的应用前景.     

超滤和丙酮沉淀法回收纤维二糖水解液中β-葡萄糖苷酶的研究

分别利用超滤和有机溶剂沉淀法对纤维二糖水解液中β-葡萄糖苷酶的回收可行性及其工艺进行了研究.利用膜技术回收时,选用截流分子质量 30 ku 膜比较适宜.连续超滤回收不同批次的纤维二糖酶解液中β-葡萄糖苷酶,第1轮的酶回收率和平均膜通量分别为 99.6 % 和 118.6 L/(m2·h);第20轮回收的β-葡萄糖苷酶为初始加酶量的 90 % 以上,且平均膜通量为 79.2 L/(m2·h).利用丙酮沉淀回收时,丙酮与纤维二糖水解液的体积比值在0.75～1.0比较适宜;温度和沉淀时间对酶的回收率影响很大.用 -20 ℃丙酮沉淀 2 h,酶回收率为 95.7 %,连续沉淀回收不同批次的纤维二糖酶解液中β-葡萄糖苷酶时,第15轮的酶回收率仍能维持在 50 % 左右,可节省所需酶量的 79 %.     

热解糖梭菌β-木糖苷酶的克隆表达及其水解木二糖的应用

对来源于Thermoanacrobacterium thermosaccharolyticum的糖苷水解酶39家族的β-木糖苷酶基因Tt-xyl39进行了重组表达和酶学性质的研究,为新型β-木糖苷酶的研发及应用奠定基础.通过比对T.thermosaccharolyticum 571的全基因组序列,从中克隆出一个新型β-...     

蒸汽爆破玉米秸秆的分段酶水解

以蒸汽爆破预处理的玉米秸秆为原料,探讨了分段酶水解和超滤回用β-葡萄糖苷酶的工艺对水解效果的影响。结果显示:三段酶解过程中由于反应产物纤维二糖和葡萄糖的及时移除,使产物对纤维素酶的抑制作用大大降低,提高了纤维素酶水解得率和纤维二糖转化为葡萄糖的效率,并且缩短反应时间。与一段酶水解工艺相比,(6+6+12)h三段酶水解蒸汽爆破玉米秸秆使纤维素水解得率从62.83%提高到70.16%,并且水解时间从72 h减少到24 h。蒸汽爆破玉米秸秆由23%的结晶区和77%的无定形区组成,经纤维素酶(6+6+12)h三段水解后,水解残渣在衍射角2θ为16°和22°处的两个衍射峰变得更加突出,衍射强度有所增强。用截留分子质量为30 ku的超滤膜回收水解液中的β-葡萄糖苷酶并进行下一轮酶解,回用第一轮β-葡萄糖苷酶的回收率为98.87%,葡萄糖的得率为92.71%;回用至第八轮β-葡萄糖苷酶的回收率为95.25%,葡萄糖的得率为90.87%。     

耐热β-木糖苷酶的可溶性表达及其应用

紫杉醇作为一种具有突出药用价值的天然抗癌药物,其在红豆杉属植物中的含量极少,且已有的紫杉醇制备方法难以满足商业需求,因此酶法制备紫杉醇的研究受到越来越多的关注.通过β-木糖苷酶水解紫杉醇类似物7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇(7-XDT)得到10-去乙酰基紫杉醇(10-DT),再进一步被乙酰基转移酶催化变成紫杉醇,此双酶...     

石榴花挥发油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶对石榴花的增香作用研究

目的:研究石榴花挥发油的化学成分及β-葡萄糖苷酶对其的增香作用。方法:使用挥发油提取器提取石榴花的挥发油,以GC-MS法进行分析鉴定,用面积归一化法获得各化合物的相对含量。结果:分别从无酶和有酶的石榴花挥发油提取物中确证了42个化合物。证明β-葡萄糖苷酶可以增加石榴花中某些香精成分的相对含量,但也使其中某些成分的相对含量减少。结论:石榴花中的化学成分十分丰富,GC-MS可以对石榴花挥发油进行良好的分离鉴定,同时证明β-葡萄糖苷酶对石榴花的增香作用不显著。     

桑粒肩天牛幼虫内切-β-1,4-葡聚糖酶的纯化及性质

经丙酮沉淀、UltrogelAcA5 4凝胶过滤、Q Sepharose离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶制备电泳 ,发现桑粒肩天牛幼虫肠液中具有所有水解纤维素成分的三种消化酶 ,并且每种酶都有不同数目的同工酶。纯化出一种内切 - β- 1 ,4 -葡聚糖酶 (EG - 1 ) ,其分子量为 2 6ku ,等电点约为pI4 0。酶的最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH为5 2 ;不耐热 ,5 0℃处理 30min ,酶活大大降低 ,70℃处理 2h ,几乎丧失全部活性 ,显示出该酶适合动物肠道反应环境 ,是内源性酶。     

木质素模型化合物与松柏醇-β-D-葡萄糖苷-[α-13C]的聚合反应的研究

为了探讨造纸废水中残余木质素与木质素前驱物之间的聚合反应机理,研究了β-O-4型木质素模型化合物与木质素前驱物松柏醇-β-D-葡萄糖苷-[α-13 C]的聚合反应方法及其反应机理.采用红外光谱、13 CNMR波谱分析聚合产物的特性及结构,并用偏光显微镜对产物进行了观察;采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定了产物的数均相对分子质量(Mn).研究表明:在漆酶的催化作用下木质素前驱物松柏醇-β-D-葡萄糖苷与木质素模型物能很完全的发生聚合,产物中不存在起始物的晶体,Mn也大大的增加了.松柏醇-β-D-葡萄糖苷能与木质素模型物聚合,为进一步研究木质素前驱物松柏醇葡萄糖苷用于废水处理的研究奠定了基础.     

夹竹桃花挥发油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶对夹竹桃花的增香和豚鼠离体子宫平滑肌的作用

目的:建立夹竹桃花挥发油GC-MS的色谱分离鉴定方法,分析夹竹桃花挥发油的化学成分和对豚鼠离体子宫平滑肌的作用。方法:采用挥发油提取器提取夹竹桃花挥发油,以GC-MS法进行分析鉴定,建立了豚鼠离体子宫模型。结果:分别从无酶和有酶的夹竹桃花挥发油提取物中确证了58和57个化合物,挥发油对豚鼠离体子宫平滑肌有收缩作用。结论:对夹竹桃的挥发油化学成分进行了比较分析结果表明,β-葡萄糖苷酶对夹竹桃花有较弱增香作用,也能增加豚鼠离体子宫平滑肌收缩。     

桑枝1-脱氧野尻霉素的提取及其含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性分析

【目的】1-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种降血糖功效较好的天然活性产物,在桑树中的含量相对较高。对超声-微波联合辅助提取桑枝中DNJ的工艺进行优化,以获得较高提取率;同时,分析桑枝水提物中DNJ含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性的相关性,以获得其中DNJ对α-葡萄糖苷酶抑制活性的贡献程度。这可能为桑枝中DNJ的提取、分离及桑枝α-葡萄糖苷酶抑制剂的极性分布等研究提供一定的依据。【方法】利用9-芴甲氧羰酰氯对DNJ进行衍生化,弥补其本身不具有紫外吸收特性的缺点,利用高效液相色谱在254 nm波长下进行定性定量检测;单因素试验分别求得微波处理时间、超声波处理时间和液料比的优化范围,以响应曲面法对超声-微波联合辅助提取DNJ三因素的平方和、均方、P值、R2等参数进行优化,获得二次多项回归方程和相应的最优提取条件;在此基础上利用系统溶剂法萃取浓缩的水提物,计算石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4种极性部分的α-葡萄糖苷酶抑制活性(通过酶标仪在415 nm波长处测定α-葡萄糖苷酶对4-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷的分解率来计算)与DNJ的含量,并对二者之间的关系进行分析。【结果】用0.05 mo L·L-1的盐酸溶液提取,微波处理9.60 min、超声波处理30.89 min和液料比46.47 m L·g-1时达到最优条件,此时DNJ的产率为0.205%,结果检验值与优化值的拟合率达99.27%,相对于对照组增长了10.86%;正丁醇部分DNJ的含量最高,乙酸乙酯次之,水部分仍含有少许,石油醚部分为零,说明正丁醇的萃取效果较好;正丁醇部分的抑制曲线趋势与乙酸乙酯部分相近,水部分与石油醚部分相近,且各萃取部分之间的IC50都差异显著,结合DNJ的含量分布,说明桑枝中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的物质间有一定的极性差异;根据各萃取部分中DNJ的含量,从其半抑制浓度中换算出DNJ的浓度,即为"其中DNJ的浓度",正丁醇部分"其中DNJ的浓度"与DNJ标准品的IC50差异不显著,说明此部分α-葡萄糖苷酶抑制活性物质几乎尽是DNJ;水部分虽含有少量的DNJ,但其活性却相对更小,可能其中含有具备提高α-葡萄糖苷酶活性的多糖等物质,或一些糖类等黏性物质影响了DNJ与酶的结合;乙酸乙酯部分"其中DNJ的浓度"比DNJ标准品的IC50小,可能是由于此部分含有个别黄酮类等对DNJ具有活性增强/协同作用,或其中含有一些游离生物碱、香豆素或黄酮苷元等物质具备相似活性;石油醚部分不含DNJ,却有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,说明桑枝中含有一些极性小的脂溶性化合物具备α-葡萄糖苷酶抑制活性。【结论】微波处理初步粉碎的新鲜桑枝,既有干燥作用又有辅助提取效果,而后用超声波辅助浸提可提高DNJ的提取效率;桑枝中主要的α-葡萄糖苷酶抑制是DNJ,除此外还可能含有一些极性相对较小的活性成分。这些结果有利于桑枝DNJ及其他降血糖活性成分的进一步研究。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A 33为材料,通过PCR技术从A 33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因编码序列.经过克隆、测序及BLA ST比对分析,证实该基因编码β-甘露聚糖酶,属于β-甘露聚糖酶家族中的一员,该基因已注册G enBank.将该基因克隆到原核表达载体pRSET-A中并转入大肠杆菌表达系统BL 21(DE 3)pLysS,经过诱导获得了此酶的高效表达.其表达量达到37.78 U/mL,酶学特性分析表明其作用的最适pH为5.0,最适温度为60℃.     

马尾松β-蒎烯合酶基因克隆以及对松材线虫侵染的响应

[目的]对马尾松β-蒎烯合酶基因PmPinS进行克隆,分析其序列特征和高抗易感马尾松中松材线虫侵染后的表达模式,为解析马尾松抗松材线虫病机制提供理论基础。[方法]采用PCR扩增技术克隆马尾松PmPinS的全长编码区序列,进行同源氨基酸序列比对和系统发育分析,利用生物信息学方法分析其基因特征;利用实时定量PCR技术分析马尾松蒎烯合酶基因在接种松材线虫后的高抗和易感马尾松中的表达模式。[结果]克隆获得马尾松蒎烯合酶基因的全长编码区序列,包含1 878 bp的完整开放阅读框,编码625个氨基酸,分子量为71.95 kD,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,含有萜类合酶典型的RR(X)8W、DDXXD和NSE/DTE结构域。系统进化分析发现,PmPinS与扭叶松(-)β-蒎烯合酶聚为一支,序列相似性达93.16%。对高抗和易感马尾松PmPinS在松材线虫接种后的表达模式进行分析发现,PmPinS在高抗马尾松中的表达量显著高于易感马尾松,且在接种30 d内呈现上升趋势,而易感马尾松PmPinS在接种1 d后迅速下降,在接种2 a后,PmPinS表达量在高抗马尾松茎部组织特异性高表达。对松材线虫外源...