香蕉ACC合成酶含3′末端的cDNA克隆

采用3′RACE方法对香蕉（Musa AAA Cavendish Subgroup）ACC合成酶含3′末端的cDNA进行扩增，扩增产物被克隆到pCR2.1载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选到重组质粒（pACS2），并对插入片段进行序列测定。结果表明，3′ARCE产物长1680bp，其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸，氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269bp的3′末端，并具有完整的Poly（A）尾（24mer）。     

香蕉ACC合成酶含3＇末端的cDNA克隆

采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

康乃馨ACC氧化酶cDNA的克隆及其序列分析

以康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)花瓣为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总RNA,根据已报道的康乃馨ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacidoxidase,ACO)基因的序列设计并合成一对引物,通过RT-PCR方法获得一约1.2kb特异片段,把该片段连接到PGEM-Teasyvector上进行测序,其全长共1156bp,编码区915bp,共编码304个氨基酸残基。序列分析结果表明该序列与国外SavinKw报道的康乃馨ACC氧化酶基因的cDNA序列完全相符。推断该基因在康乃馨种内可能是完全或高度保守的。      

龙眼胚性愈伤组织ACC合成酶基因（DL-ACS1）的克隆及表达分析

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到龙眼胚性愈伤组织乙烯合成限速酶DL-ACS1(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase)基因的cDNA全长序列(GenBank,FJ617537),共1 817 bp,包含了5’非编码区(73 bp),开放阅读框(1 437 bp),3’非编码区(307 bp)。该cDNA开放阅读框的氨基酸序列(含478个氨基酸)与其它植物ACS具有77%～63%同源性,属于ACC Synthase家族。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)各阶段的表达量存在较大的时期差异,其中,球形胚(Stage 5)的表达量最高,鱼雷形胚(Stage 7)的表达量最低。     

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。     

番茄1-氨基环丙烷羧酸ACC合成酶基因的克隆及其反义基因表达载体的构建

从成熟番茄果实中分离mRNA，以Oligo（dT）为引物在AMV逆转录酶作用下合成ACC2cDNA第一链，以cDNA为模板通过PCR扩增ACC2基因，获得1.45kb的扩增片段，将此片段克隆到BS质粒的EcoRV位点上，对插入片段两端进行部分序列分析，随后，将此片段以反方向插入双元载体pBI151的35S启动子和NOS终止子之间，通过三条交配法将携带反义ACC2基因的中间表达载体pBA7转入根癌农杆菌LBA4404，得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

水稻柠檬酸合酶编码基因的初步研究

 以粳稻cDNA为模板，设计一对特异性引物，获得编码水稻柠檬酸合酶基因的cDNA序列，全长为1470 bp，ORF区含475个氨基酸，推定蛋白序列与红葡萄、烟草、甜菜、拟南芥和柑橘等物种都有较高的同源性（>70％），氨基末端含一线粒体靶信号。Southern分析表明此基因在水稻基因组中具有多个拷贝数。经0.4 mmol/L IPTG诱导,根据Western印迹分析获得预测的蛋白大小为59 kD。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank 登记号GQ200741）。cDNA序列全长1940bp,其中包含114bp的5’前导序列和134bp的3’不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

辣椒MADS-box基因CaMADS的及表达分析

根据植物MADS-box基因的保守区设计简并引物,进行PCR扩增获得一个辣椒MADS-box基因片段,在此基础上通过RACE方法获得了辣椒编码MADS-box基因的cDNA序列(命名为CaMADS).序列分析结果表明,CaMA DS基因全长943 bp,含有744 bp的阅读框,25bp的5'-UTR和174 bp的3...     

香蕉ACC合成酶含3''''末端的cDNA克隆

采用 ３＇ＲＡＣＥ方法对香蕉（Ｍｕｓａ ＡＡＡ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ）ＡＣＣ合成酸含 ３＇末端的 ｃＤＮＡ进行扩增，扩增产物被克隆到ｐＣＲ■２．１载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５ α，筛选到重组质粒（ｐＡＣＳ２），并对插入片段进行序列测定。结果表明，３＇ＲＡＣＥ产物长 １６８０ ｂｐ，其中一个 开放读框内的核苷酸序列编码４４４个氨基酸，氨基酸序列包括了ＡＣＣ合成酶中所应具有的７个高度保守区。同时该产物还有长２６９ ｂｐ的３＇末端，并具有完整的 Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（２４ｍｅｒ）。     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。     

蝴蝶兰蔗糖合成酶基因的cDNA克隆及其表达分析

利用低夜温诱导的蝴蝶兰花芽的抑制消减杂交文库中分离的蔗糖合成酶基因的ESTs片段,采用RT-PCR和RACE技术,从蝴蝶兰花芽中克隆得到蔗糖合成酶基因的全长cDNA,命名为PhSUS,GenBank登录号JX162557.该基因全长2 816 bp,包含147 bp的5’非编码区、218 bp的3 '非编码区和一个长度为2 451 bp编码816个氨基酸的开放阅读框.PhSUS预测的分子量为93.30 ku,等电点为5.95.蛋白同源性分析结果表明,PhSUS与兰科植物的文心兰、石斛兰和莫氏兰(Mokara)等的蔗糖合成酶有很高同源性.保守结构域分析结果表明,PhSUS含有蔗糖合成酶和葡糖基转移酶两个保守功能域及4个ADP结合位点.表达分析结果表明,PhSUS在检测的组织中都有表达,但表达丰度不同.PhSUS在花蕾发育中后期、成熟花和花器官的表达量都较营养阶段根和叶中的表达量高.PhSUS的克隆为研究其参与花芽分化和发育的表达调控奠定了重要基础.     

海南龙血树查尔酮合酶基因(DcCHS)的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆,得到1条1 456 bp的cDNA序列,命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区,编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上,具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku,等电点pI为6.14,稳定性极差,具有15个磷酸化位点,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位在细胞质的可能性较大,并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明,DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

琯溪蜜柚汁胞APX1 cDNA的克隆及原核表达

为了解琯溪蜜柚(Citrus grandis‘Guanximiyou’)汁胞在发育过程中,APX与汁胞活性氧自由基清除和汁胞粒化的关系,以琯溪蜜柚果肉为材料,运用cDNA克隆的方法,克隆得到琯溪蜜柚果肉APX1cDNA全长,并进行了原核表达。结果表明:获得了全长为1118bp的琯溪蜜柚汁胞APX1cDNA全序列,包含753bp的开放阅读框,编码250个通读的氨基酸序列。具有过氧化物酶活性位点信号和亚铁血红素结合基信号。目前APX1cDNA序列已在GenBank上注册,登录号为gb|FJ595794.1。通过构建重组质粒p32-APX1,转化至TransRosetta(DE3)中,在大肠杆菌宿主中获得了表达,从而为下一步制备该酶抗体及研究琯溪蜜柚汁胞粒化过程中APX1的功能奠定了基础。     

玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。     

茶树ACC合成酶基因全长cDNA的克隆及其生物信息学分析

乙烯是一种重要的植物激素,参与植物许多生理过程。ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成酶(ACS)是植物乙烯合成过程中的限速酶,对乙烯的合成具有重要的调控作用。利用其它植物ACS基因的保守序列设计兼并引物,采用RACE(Rapid Amplificationc DNA Ends)和RT-PCR等技术,克隆得到编码茶树ACS基因的全长cDNA序列,长1579bp,编码478个氨基酸,预测分子量约为53.7kD,等电点8.039,GenBank登录为EF205149。以Neighbor-Joining法构建进化树,发现茶树ACS基因与柿树中的同类基因亲缘关系最近。茶树ACS基因的克隆为从分子水平认识乙烯在茶树上的生理作用奠定了基础。