家蚕线粒体基因组1.8kb片段的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕 (Bombyxmori)线粒体基因组 1781bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶切片段序列 ,根据序列同源性比较 ,推测该DNA片段包括 :ND1基因、16SrRNA基因 3′端、tRNALeu(UAG)基因和一个尚待确定的tRNA基因。家蚕与果蝇ND1基因序列同源性约为 81 85 % ,16SrRNA基因 3′端序列同源性约为 74 5 %。在家蚕、果蝇、蜜蜂、蝗虫、卤虫和人 6个物种中 ,线粒体ND1编码的疏水性氨基酸比例较稳定 ,显示了ND1基因的保守性。对上述 6个物种ND1基因序列和 16SrRNA基因 3′端序列进行系统进化分析 ,构建了系统进化树。     

蓖麻蚕线粒体cox2基因的克隆、序列测定和分子系统学分析

利用兼并性引物克隆出蓖麻蚕线粒体cox2基因、tRNA Leu基因和cox1基因的部分片段。cox2基因编码框包含 6 85个核苷酸 ,编码 2 2 8个氨基酸的蛋白质 ;起始密码子为ATG ,终止密码子仅有 1个T组成 ;蓖麻蚕mtDNA的cox2基因中富含AT ,含量为 75 77% ,GC的含量为 2 4 2 3%。通过同源性比较 ,发现蓖麻蚕的cox2与柞蚕cox2同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 89 0 %和 96 0 %。根据cox2氨基酸序列进行了 12种昆虫的分子系统学分析探讨。     

家蚕地方品种线粒体基因组A+T丰富区的序列及分子进化分析

为了研究家蚕线粒体基因组A+T丰富区的结构和家蚕品种的进化,用PCR方法扩增了12个家蚕(Bombyxmori)地方品种线粒体基因组A+T丰富区及其侧翼序列,分离纯化后克隆到pMD18-T载体进行测序。序列分析表明,克隆片段长度约1.1 kb,基因排列顺序与C108线粒体相同,依次为12S rRNA基因3′端、A+T丰富区、tRNAMet、tRNAIle、tRNAGln和ND2基因5′端,在tRNAGln和ND2基因之间有47 bp的非编码区。以日本野桑蚕(Bombyxmandarina)为外群,用Phylip软件包构建了基于12个家蚕品种线粒体基因组A+T丰富区序列的NJ进化树。结果显示,甘肃种单独聚为一群,其进化早于其它11个品种聚成的类群,说明甘肃种是供试家蚕品种中进化最早的品种。这一结果在分子水平上为黄河流域是家蚕品种的发祥地之一提供了证据,也进一步支持了家蚕品种的中国起源说。对A+T丰富区及其侧翼基因的结构分析表明,家蚕线粒体12S rRNA和ND2基因都十分保守,14个品种统计只分别发生1个和2个碱基转换;A+T丰富区中(A+T)比例高达94.9%以上,第27 nt开始有1个T-串结构,长度为16~19 bp不等;同时还根据3个tRNA基因的核苷酸序列推定了其二级结构。     

家蚕蛹线粒体DNA EcoRⅠ 1.9kb片段的克隆及序列分析

克隆了二化性家蚕蛹体的线粒体DNAEcoRⅠ酶解 1 .9kb片段 ,并进行了序列测定。结果表明 :克隆片段中包含完整的线粒体赖氨酸转移RNA(tRNA Lys)基因、天冬氨酸转移RNA(tRNA Asp)基因、ATP合酶亚基Ⅷ基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ、ATP合酶亚基Ⅵ基因的部分序列。并与果蝇线粒体DNA的同源性和参照果蝇线粒体DNA密码子翻译的氨基酸顺序进行了比较 ,由tRNA的一级结构推断出可能的二级结构模型     

蓖麻蚕核型多角体病毒解旋酶基因的克隆和序列分析

为了解柞蚕核型多角体病毒(Antheraea pernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)和蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia riciniNPV,PcrNPV)在感染性及基因水平上的差别,克隆了PcrNPV解旋酶基因helicase,对该基因进行了测序及同源性分析。感染性试验表明,ApNPV对柞蚕和蓖麻蚕的感染率分别为78%和57%;而PcrNPV对蓖麻蚕的感染率为79%,但几乎不感染柞蚕。对PcrNPVhelicase分析的结果表明,该基因长度为3 639 bp,编码1 212个氨基酸(登录号:EU143371)。基因的同源性分析表明,PcrNPVhelicase与ApNPVhelicase的同源性最高,达98.6%,与苜蓿银纹夜蛾NPV(Autographa califorlicaNPV,AcNPV)helicase和家蚕NPV(BombyxmoriNPV,BmNPV)helicase的同源性最低,分别为58%和58.8%。PcrNPV和ApNPV的helicase基因7个保守功能域上的氨基酸序列均相同,仅在靠近DNA结合区螺旋-转角-螺旋结构处的第974位上有1个氨基酸不同,推测该位点可能与宿主域范围有关。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。     

蓖麻蚕(Attacus ricini)核糖体RNA基因酶切图谱无性繁殖和物理图以及结构基因的定位

真核细胞基因的表达调控.尤其是调控基因的结构和功能是当前分子遗传学研究的重要方面.核糖体RNA(rRNA)基因(rDNA),由于它在生物学功能上的重要性.而受到广泛研究.近年来某些rDNA已被无性繁殖(克隆).对其结构的研究,发现有不同程度的非均一性.但家蚕的TBNA是均一的.蓖麻蚕rDNA的研究未见报导.我们以蓖麻蚕rDNA为对象研究rDNA表达调控基因的结构及其作用模式.     

山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL(HSP60)基因的克隆测序及分析

对疑似感染山羊的无浆体16SrRNA基因、主要表面蛋白4(MSP4)和编码HSP60的GroEL基因进行克隆测序及系统发育分析。发现所克隆的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列长度分别为1 464、870、977bp,GenBank登录号分别为JX898992、JX898990和JX898991。所获得的无浆体16SrRNA序列及GroEL序列与公布的羊无浆体南非OVI株(16SrRNA:AF414870;GroEL:AF441131)同源性最高,分别为98.8%和99.8%,而MSP4序列与重庆忠县羊无浆体ZX17株(HQ840746)同源性最高,达100%。系统发育分析显示,本试验获得的无浆体16SrRNA、MSP4和GroEL基因序列均被聚类到羊无浆体群。本试验首次同时克隆分析了山羊无浆体16S rRNA、MSP4和GroEL基因序列,从分子水平证实羊无浆体在重庆存在,建议在进行无浆体种类鉴定时,最好同时选择2个或2个以上物种鉴定基因进行克隆分析,以确保研究结果更可靠。     

鹧鸪线粒体COII、ATPase8和3个tRNA基因序列分析及物种鉴别研究

线粒体DNA是真核生物核外遗传物质,其结构简单,发生变异的机率相对稳定,被广泛用于系统起源、进化、亲缘关系及物种鉴别的研究中。为了挖掘禽类(源性成分)鉴别的分子生物学数据,探讨线粒体不同基因发育信息及鉴别的可信度和灵敏度。本研究扩增鹧鸪线粒体基因组中COⅡ、ATPase8区域,克隆出1138 bp片段,测序结果分析表明,在所克隆的片段中,含有COⅠ基因部分序列、tRNASer基因、tRNAAsp基因、COⅡ基因、tRNALeu基因、ATPase8基因全序列和ATPase6基因部分序列。分析COⅡ、ATPase8和tRNA基因显示其与鹌鹑、鸡、火鸡、鹅、鸵鸟5种禽类的序列均具有较高的同源性,基于它们用MEGA3.1构建系统进化树,探讨了它们所含的信息量及在鹧鸪和其它禽类鉴别方面的应用潜力,发现COⅡ比AT-Pase8和tRNA基因含有更多的鉴别信息。     

关于家蚕基因工程手法的基础研究——特定基因的克隆(cloning)与构造解析

Ⅰ研究目的家蚕在遗传学、生理学方面,是日本最古研究的生物之一。另一方面,近年以分子生物学为基础,各种基因工程的手法被设计、作出。以家蚕确立此等手法,对家蚕的品种改良固不待言,即使在其他领域(分野),其利用价值想来是高的。因此,本课题作为基础研究之一,进行特定基因的克隆(coning)与构造解析的手法研究。Ⅲ方法材料,是以蓖麻蚕后部丝腺作为插入DNA(insert DNA)的供给源。为调整离体包装混合(in vitro Packaging mix)     

绢丝昆虫卵黄原蛋白一级结构的特性分析

家蚕、天蚕、蓖麻蚕、柞蚕、野桑蚕、透目天蚕、樟蚕7种绢丝昆虫分别属于鳞翅目的家蚕蛾科和天蚕蛾科的不同属。通过对7种绢丝昆虫卵黄原蛋白一级结构保守序列如信号肽序列、多聚丝氨酸、糖基化位点等的比较和分析,并进一步根据氨基酸的同源性构建了系统树。结果证明了7种绢丝昆虫的卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有很好的保守性,其中蓖麻蚕和樗蚕的亲缘关系最近,家蚕蛾科的野桑蚕和天蚕蛾科的樟蚕的亲缘关系最远。     

柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA3′端的克隆及序列分析

柳蚕(Actias seleneHbner)是野生泌丝昆虫。从柳蚕雌蛹脂肪体中提取总RNA,根据已经解析出的其它泌丝昆虫的卵黄原蛋白cDNA序列设计特异性引物,对柳蚕卵黄原蛋白cDNA3′端进行RACE(rapid amplification ofcDNA ends)扩增,经克隆和测序得到了一条1 072 bp的cDNA片段,该序列与柞蚕(Antheraea pernyi)、天蚕(An-theraea yamamai)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、家蚕(Bombyxmori)、樗蚕(Samia cynthia pryeri)、蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricini)、樟蚕(Saturnia japonica)相应序列的同源性分别为82.5%、82.4%、67.0%、63.2%、80.3%、78.5%、81.0%。同源性分析表明,昆虫卵黄原蛋白的一级结构在进化上具有较高的保守性。     

几种绢丝昆虫遗传多样性的RAPD研究

选用重复性较好的 10个引物对 6种绢丝昆虫 2 3个个体进行扩增 ,共得到 2 45个RAPD标记。RAPD分析结果表明 :家蚕及野桑蚕种内各品种材料的遗传距离较大 ,天蚕、蓖麻蚕及柞蚕较小 ;家蚕与野桑蚕两者之间遗传距离小 ,反映出家蚕和野桑蚕亲缘关系较近 ;而天蚕、蓖麻蚕和柞蚕三者之间以及分别与家蚕和野桑蚕之间的遗传距离较大 ,亲缘关系远。聚类分析的结果与之相同。并且对家蚕的起源及绢丝昆虫遗传多样性的保护利用做了探讨。     

蓖麻蚕核型多角体病毒p6.9基因的克隆及序列分析

基于丰富蓖麻蚕核型多角体病毒(Philosamia cynthia ricininucleopolyhedrovirus,PcrNPV)分子信息的目的,对PcrNPV DNA部分片段进行了测序分析,获得1个DNA结合蛋白基因p6.9的完整序列。该基因的读码框由240个核苷酸组成,编码79个氨基酸,分子质量约为9.8 kD,转录起始位点ATG侧翼序列符合Kozak规则,其上游34bp处具有晚期基因转录的保守起始序列taag,表明该基因为晚期表达基因。将PcrNPV与12种昆虫核型多角体病毒P6.9蛋白氨基酸序列作同源性比较的结果显示:PcrNPV P6.9蛋白氨基酸序列与家蚕(Bombyx mori)NPV P6.9的同源性为59%,与柞蚕(Antheraea pernyi)NPV的同源性为100%,表明PcrNPV与ApNPV的亲缘关系很近。     

家蚕主要血浆蛋白质的发育变化及与其它蚕的比较研究

用SDS-聚丙烯酰腔凝胶电泳(SDS—PAGE)法,观察了家蚕不同发育阶段血液主要血浆蛋白质浓度的发育变化,比较了不同的地方性三眠蚕品种间主要血浆蛋白质组成及浓度的异同。比较家蚕与野桑蚕、蓖麻蚕、樗蚕及柞蚕血浆的电泳图谱,发现家蚕与野桑蚕的电泳图谱相似而不同于蓖麻蚕、樗蚕和柞蚕。后三者之间的电泳图谱很相似,它们不存在类似于家蚕及野桑蚕中的分子量为30KD的一组蛋白质,但也存在分子量相当于家蚕贮藏蛋白质的成分。用精制的家蚕贮藏蛋白质、30K蛋白质和卵黄磷蛋白分别制备免抗血清,并使之与五种试验蚕的血液分别进行了双向免疫扩散试验。     

蚕丝心蛋白的亚基及其分子量、氨基酸组成研究

试验以家蚕、野桑蚕、天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为材料，测定了丝心蛋白及其亚基的分了量和氨基酸组成。结果表明，丝心蛋白亚基的组成家蚕、野桑蚕表现为Ｈ－Ｌ型，天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为Ｈ－Ｈ型。家蚕蛾科的蚕类与天蚕蛾科的蚕类在丝心蛋白氨基酸组成上，具有种待异性，各种蚕类丝心蛋白氨基酸组成差异同它们的分类地位相一致。从家蚕和野桑蚕绢丝腺液状丝心蛋白中分离出小亚基，小亚基的氨基酸组成和大亚基有很大不同。     

天蚕、柞蚕线粒体DNA（mtDNA）的限制性酶切电泳图谱

采用差速离心和碱变性法，以９种限制性内切核酸酶对天蚕和柞蚕ｍｔＤＮＡ进行了单酶切分析，发现这两种蚕的ｍｔＤＮＡ在分子长度和酶切类型上存在明显差异。还对天蚕、柞蚕、蓖麻蚕和家蚕的ｍｔＤ－ＮＡ限制性酶切电泳图谱进行了比较研究。