大肠杆菌菌毛抗原K99与耐热肠毒素STⅠ融合基因的克隆与核苷酸序列测定

采用PCR技术，从大肠杆菌K99中扩增出0．54kb的K99菌毛抗原基因，然后将其克隆到pUCm—T载体上，用Bgl Ⅱ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，通过T4连接酶与同样经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切合成的耐热肠毒素ST Ⅰ核苷酸序列连接，通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析，证明插入的K99-ST Ⅰ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。     

大肠杆菌不耐热性肠毒素LT_B基因的克隆及其核苷酸序列分析

用内切酶ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切大肠杆菌质粒ｐＥＷＤ２９９，回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段，再将载体ｐＵＣ１８用ＳａｃⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切，最后将ｐＵＣ１８ＤＮＡ与５０５ｂｐ的ＬＴＢＤＮＡ进行连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＳａｃⅠ／ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１。再将ｐＸＬＴ１进行ＥｃｏＲⅠ酶切、大肠杆菌聚合酶ⅠＫｌｅｎｏｗ大片段补平、ＨｉｎｄⅢ酶切处理，然后与用ＨｉｃⅡ和ＨｉｎｄⅢ酶切的ｐＵＣ１８连接，转化至受体菌ＤＨ５α中，经ＸｂａⅠ／ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子，得到了理想重组子质粒ｐＸＬＴ１－１。将质粒ｐＸＬＴ１－１进行核苷酸序列分析，确定了插入的ＬＴＢ基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列     

羊流产衣原体主要外膜蛋白基因的克隆与序列分析

将自行分离、传代培养的内蒙古地区山羊流产衣原体按常规方法分离纯化，提取衣原体基因组DNA作为模板，按照国外发表的衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因两端序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出－1.17Kb的DNA片段。利用引物上预先设计的限制性内切酶位点，将扩增片段经限制性内切酶切割后连接到pUC19质粒相应位点上，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。经PCR检测和内切酶分析鉴定含MOMP基因的重组子质粒。对克隆处段进行全序列分析，结果证明得到MOMP全编码序列的基因克隆。本株衣原体MOMP编码区由1170个核苷酸组成。序列比较发现本株衣原体的MOMP基因与国外的羊流产衣原体S26／3株的MOMP基因完全相同，与B577株的MOMP基因仅有一个核苷酸的同义变异。     

鸭肠炎病毒PCR产物的克隆及鉴定

根据已发达的鸭肠炎病毒（DEV）基因的核苷酸序列，设计并合成了1对引物，以鸭肠炎病毒DNA为模板扩增出602bp的基因片段，将该基因片段通过粘端连接克隆到质粒pBluescipt ⅡKS^ 中，重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胸质，在LB平板上筛选重组菌，重组子经聚合酶链反应（PCR）和HindⅢ与PstⅠ双酶切鉴定，该基因片段已成功的克隆到质粒载体上。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析

通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株（SY株）的免疫原S1基因cDNA，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ/BamHⅠ酶切位点中，测定插入片段核苷酸序列，并推导出其氨基酸序列。序列分析表明，SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H120、N1-62、Gray、6/82、Ark99等毒株的同源百分率都低于80%。     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。     

猪PHGPx基因真核表达重组质粒的构建与鉴定

从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E．coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载...     

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因原核表达载体的构建及其表达

经PCR从含有APXⅡA基因片段的重组质粒pT—APXⅡA中扩增出了APXⅡA基因。同时对目的基因和表达质粒pGEX-4T-1进行了双酶切，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析，证明连接向位和阅读框架正确。成功构建了APXⅡA基因的原核表达载体pGEX—APXⅡA。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS—PAGE分析表达目的蛋白。结果表明，蛋白质的分子质量为102．5ku。     

鹅细小病毒主要结构蛋白基因的扩增、克隆与原核表达载体的构建

根据已发表的鹅细不病毒（GPV）核苷酸序列设计并合成了1对引物,对GPV主要结构蛋白VP2和VP3基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.8kb。将该片段直接与真核表达pCR3.1T载体连接,转化人感受态大肠杆菌TOP10F＇中增值。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增以及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶Sca I 和EcoR V分别酶切进行正反向鉴定,获得了3个正向插入的克隆（PVPA）和2个反向插入的克隆（PVPB）。将正向插入的克隆PVPA1与原核表达载体pET-28b（ ）分别用BamH I和Xho I双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5a中。对所获得的重组质粒分别经Sca I、EcoR V、BamH I/Xho I酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功地构建了含有GPV主要结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达以及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。     

马动脉炎病毒膜蛋白基因截短型的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列，设计合成了1对引物，从pUC18-M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及pGEX-6P-1载体双酶切并连接，成功构建了原核表达载体pGEX-6P-Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌，对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化；诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析发现，在约34ku处出现了1条特异性的蛋白条带，其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符，并随着诱导时间的延长而变化，在诱导后4h达到高峰。结果表明，膜蛋白M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。     

鸡致病性大肠杆菌肠毒素(LT)的鉴定及其基因的克隆

鸡致病性大肠杆菌分离株O78经家兔肠袢结扎试验(RILT)证实,该菌株产生热敏性肠毒素(LT)。用PCR技术从该菌株中扩增出1.2kb的LT基因,然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化至受体菌JM109中。用Amp/IPTG/X-gal琼脂平板蓝白菌落筛选得到阳性重组菌株,提取质粒用SphI和SalI双酶切鉴定,结果证实,构建的克隆质粒pXCLT1含有LT基因。     

传染性法氏囊病病毒VP5基因的克隆与原核表达

根据GenBank已登录的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP5基因序列,设计合成了一对VP5基因特异性引物,应用RT-PCR技术从IBDV标准毒株中扩增得到VP5基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了重组原核表达质粒pGEX-6P-1-VP5,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,IBDV VP5基因在大肠埃希菌BL21中得到了正确表达,所表达的融合蛋白与IBDV阳性血清具有特异性抗原抗体反应。     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白与新城疫病毒F蛋白的融合表达及免疫原性分析

应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因以及含有新城疫病毒F蛋白部分表位的基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆到质粒pET30a+上,获得重组原核表达质粒pET-fliC-F,将其转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。Western blot证实重组菌表达的fliC-F融合蛋白能与小鼠抗fliC和抗F蛋白两种多抗血清发生特异性反应。动物试验显示,fliC-F融合蛋白能够刺激C3H/HeJ小鼠产生针对F蛋白的特异性血清抗体,说明原核表达系统表达的fliC-F融合蛋白具有较好的免疫原性。     

Linkage of genes for heat-stable enterotoxin, drug resistance, K99 antigen, and colicin in bovine and porcine strains of enterotoxigenic Escherichia coli

Linkages among genes for production of Escherichia coli heat-stable enterotoxin (ST), drug resistance, K99 antigen, and colicin were investigated in 2 bovine and 3 porcine strains of enterotoxigenic E coli. In conjugation experiments, all 5 isolates transferred enterotoxigenicity and the ability to produce K99; 4 of the 5 isolates also transferred antibiotic resistance markers, and 3 colicinogenic strains transmitted the ability to produce colicin. In 2 of the 3 colicin-producing strains, the genes for colicin were located along with those for K99 and ST on a single plasmid. One of these 2 strains transferred the genes for tetracycline resistance and production of both mouse-active ST (STa) and mouse-inactive ST, whereas the other transmitted the gene(s) for STa only. Transformation studies with the 3rd strain revealed that the K99 determinant resided on a 22-megadalton (Mdal)R plasmid, and that STa and colicin production were on a 65-Mdal plasmid. Analysis of the plasmids from the transformation experiments revealed that the larger plasmid was conjugative and the smaller plasmid was nonconjugative; stable cointegrate formation occurred between these 2 plasmids. Genetic information coding for the production of STa and K99 were also present on a single plasmid of approximately 80 Mdal in both noncolicinogenic strains.     

牛GM-CSF与金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB共表达质粒的构建与原核表达

采用PCR方法对牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和金黄色葡萄球菌FnBPB的D区进行特异性的扩增,并通过重叠延伸PCR扩增GM-CSF-FnBPB串联基因,构建了克隆质粒pMD19-GM-CSF-FnBPB。利用表达载体pET-32a(+)对该融合基因片段进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,在1mmol/L IPTG诱导浓度下,在39ku处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带,Western blot分析表明,该蛋白具有反应原性,进而证明该融合基因成功在原核细胞中表达。     

H9亚型禽流感病毒HA1基因的克隆表达及其生物学活性的初步分析

根据GenBank已发表序列设计引物，通过RT-PCR成功获得了H9亚型禽流感病毒北京分离株A／Chicken／Beijing／1／96（H9N2）的HA1片段，经序列分析HA1片段与其他已发表序列同源性为95％～98％。将HA1片段克隆入pET．28a的多克隆位点构建重组质粒pET28-H9HA1并转化宿主菌BL21（DE3），用IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实，H9HA1片段得到表达，并且表达的蛋白带分为42Ku和23Ku两条。血凝实验和血凝抑制实验表明原核表达的HA1蛋白不具备血凝活性，其阳性血清不能引起血凝抑制。交叉反应实验证实原核表达的重组蛋白能与禽流感病毒H9亚型单特异性血清反应，而与禽流感病毒H5、H7亚型以及其他禽传染病病原微生物单特异性血清无交叉反应。说明表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性，有开发成为H9亚型禽流感检测试剂的可能。     

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.