猪源牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为检测猪源牛病毒性腹泻病毒,根据牛病毒性腹泻病毒5′端非编码区基因保守序列设计引物,建立了检测牛病毒性腹泻病毒一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对牛病毒性腹泻病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性,对牛病毒性腹泻病毒检测的灵敏性为1 pg总RNA量,应用该方法检测临床病料和猪瘟细胞毒活疫苗样品结果显示,该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高,可用于猪瘟细胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)外源病毒检测。     

一步法RT-PCR快速检测猪瘟活疫苗中BVDV外源病毒方法的建立

为检测商品化猪瘟细胞毒活疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染,根据牛病毒性腹泻病毒5′端非编码区基因保守序列设计引物,建立了检测牛病毒性腹泻病毒一步法反转录—聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对牛病毒性腹泻病毒扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性,对牛病毒性腹泻病毒检测的灵敏性为1pg总RNA量,应用该方法,检测了32批猪瘟细胞毒活疫苗样品,以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测速度快、特异性强、敏感性高,可用于猪瘟细胞毒活疫苗中污染的牛病毒性腹泻病毒外源病毒检测。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了BVDV的RT-PCR检测方法。该方法从BVDV标准毒株NADL中扩增出了279bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、MDBK细胞等的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1×TCID50。提取9份细胞毒总RNA后,进行一步法RT-PCR扩增可获得一致的检测结果,说明该方法重复性很好。应用该方法对45份临床疑似患牛的样品进行检测,结果检出4份阳性,表明该方法具有较好的临床应用性,且检测结果与参考实验室检测结果完全相符,可用于BVDV的快速诊断。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10^-1 TCID₅₀/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种特异性检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的RT-PCR方法,并且可以实现在同一体系中对BVDV进行分型。根据GenBank中公布的BVDV基因组序列,针对高度保守的5′UTR区域分别设计鉴定及分型引物,建立牛病毒性腹泻病毒鉴定及分型RT-PCR检测方法。应用鉴定RT-PCR检测方法可从BVDV阳性毒株中扩增出288bp的特异性片段;而分型RT-PCR检测方法可在同一体系中从BVDV1型和2型毒株中扩增出大小分别为316bp和110bp的特异性片段,但对猪瘟病毒、牛副流感3型病毒及牛传染性鼻气管炎病毒等均为阴性,最低可检测出的病毒量分别为1TCID50/mL和10TCID50/mL。临床试验证明,建立的鉴定及分型RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,具有很高的实用价值,为进一步开展流行病学调查、病毒分离等提供可靠的技术手段。     

一步法 RT-PCR 快速检测猪流行性腹泻病毒

对猪流行性腹泻病毒N基因保守序列设计了1对引物,建立了检测猪流行性腹泻病毒一步法反转录-聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对猪流行性腹泻病毒（PEDV）扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪流行性腹泻病毒检测的灵敏性为100 pg总RNA量。以上结果表明,该一步法RT-PCR特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪流行性腹泻的早期确诊和病毒鉴定。     

牛病毒性腹泻—粘膜病病毒株(长春184)的分离与鉴定

对1980年从怀疑为牛病毒性腹泻—粘膜病病牛的流产胎儿脾脏分离出的一株病毒(长春184V株),进行了形态学观察、组织细胞培养、理化学试验、与标准毒株的交互中和试验和牛的人工感染试验等,证明与国外报道的牛病毒性腹泻——粘膜病病毒的基本特性相符,而且能与抗猪瘟血清发生中和反应,从而确认该毒株是具有特征性细胞病变效应的牛病毒性腹泻—粘膜病病毒,对牛肾细胞培养的感染滴度可达10~6TCID_50/ml。     

牛病毒性腹泻病毒一步法.RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区基因保守序列设计引物,建立了检测BVDV一步法反转录-聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。结果表明,该方法对BVDV检测的灵敏度达到1pg RNA,特异性强、敏感性高,可用于牛病毒性腹泻病的早期确诊和病毒鉴定。     

延边黄牛BVDV一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立延边黄牛牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的一步法RT-PCR检测方法,根据Gen Bank上已登录的BVDV基因序列,应用Oligo 6.0设计一对特异性引物,建立BVDV的一步法RT-PCR检测方法,并将该方法应用于临床检测。结果显示,该方法对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的基因扩增均为阴性,敏感性为1 ng基因组RNA,具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于延边黄牛BVDV感染的早期诊断和病原体监测。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况.本试验的目的 是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法.通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒荧光探针定量RT-PCR检测方法的建立

为建立牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)的快速检测方法,本研究采用Sephycral S-400凝胶对牛精液过滤处理后提取病毒核酸,根据BVDV-1 5'UTR保守区基因序列,设计特异性引物和荧光探针,通过反应条件的优化,建立了牛精液中BVDV-1荧光定量RT-PCR检测方法.该方法可以检测到牛精液中含量为0.0125 TCID50的病毒,灵敏度比病毒分离方法高200倍～2000倍,比常规RT-PCR方法高10倍.对从同一个牛场6个月内采集的120份新鲜牛精液和40份冷冻牛精液用该荧光RT-PCR方法检测,没有检测到BVDV-1阳性样品.对其中的10头牛定期检测精液中病毒的同时,并同步检测了全血中的病毒和血清抗体,结果血清抗体阳性牛精液中没有检测到病毒,本研究结果表明,不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据.     

牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒3型三重RT-PCR检测方法的建立及应用

根椐GenBank中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)3种病毒基因序列,设计合成引物,建立3种病毒的三重RT-PCR方法。用这3对引物对同一样品中的BVDV、BRSV和BPIV-3核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果显示:可同时扩增BVDV的466 bp,BRSV的735 bp和BPIV-3的258 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV-3和10 pg的BRSV模板。用37份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示:两者的总符合率为100%。结果表明:建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立和初步应用

根据GenBank上已发表的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因序列,进行对比分析,分别设计合成两对能特异性扩增CSFV、BVDV的引物。经过条件优化后,建立了检测CSFV和BVDV的双重RT-PCR方法,扩增两种病毒的片段,大小分别为938、650 bp。应用该方法对11批牛睾丸细胞、7批胎牛血清、60个批次的猪瘟细胞苗、10份全血样及10份组织样进行检测。通过试验证明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,为防止猪瘟细胞苗的污染及进行CSFV和BVDV鉴别诊断提供了有效方法。     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

Persistent infection and immunologic tolerance are important characteristics of bovine viral diarrhea disease, which have caused great difficulties on the diagnosis, quarantine and prevention of the bovine viral diarrhea virus (BVDV), so a fast and efficient detection method of BVDV is quite necessary. A pair of primers were designed based on the gene sequences of BVDV 5′UTR published in GenBank, then established the Real-time fluorescent quantitative RT-PCR detection method with SYBR Green Ⅰ to detect BVDV. The results showed that the detection method had high specificity, strong sensitivity and good repeatability. Thus, the detection method of the Real-time fluorescent quantitative RT-PCR would provide an effective means for the rapid detection of BVDV and persistent infected animals. It could supplement and perfect the quarantine and diagnostic methods of BVDV.