小麦低分子量麦谷蛋白亚基研究进展

对小麦LMW—GS的分类、结构、在染色体上的定位以及分子标记的开发和对小麦品质的贡献等方面进行了阐述,为LMW—GS在小麦育种方面的应用提供理论基础。     

低分子量麦谷蛋白亚基研究进展（摘要）

低分子量麦谷蛋白（LMW-GS）占总的小麦谷蛋白的40%,是小麦品质改良的主要目标之一。就LMW-GS的分类、LMW-GS编码基因染色体位点及结构特点、LMW-GS多肽链组成、Genbank注册的基因及分子标记的开发、不同LMW-GS对加工品质的影响等几个方面进行了系统论述,为低分子量麦谷蛋白亚基用于小麦品质改良提供了理论基础。     

普通小麦低分子量麦谷蛋白亚基与农艺性状和品质性状关系的研究

研究了普通小麦低分子量麦谷蛋白亚基与农艺性状和品质性状的关系，并对利用高，低分子量麦谷蛋白亚基共同预测品质进行了分析，结果表明，低分子量麦谷蛋白亚基与农艺性状和品质性状都有一定的相关关系，但与农艺性状相关密切的亚基大多与品质性状没有显著的关系；逐步回归分析表明，利用两种蛋白组分共同预测品质，结果比一种组分更准确可靠，在对沉淀值的分析中，人选的亚基（按效应值排列）增效谱带依次为LGlu12,LGlu1,HGlu1,HGlu7 8,LGlu10,LGlu9,HGlu5 10,LGlu15；减效谱带依次为LGlu5,LGlu13,LGlu7。复决定系数R^2=0.5776，表明沉淀值变异的57.76%可由上述11个高，低分子量麦谷蛋白亚基的线性关系说明。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基在杂种后代的品质差异

利用２个小单交组合的Ｆ２群体,研究了不同高分子量麦谷蛋白亚基在几个品质性状上的差异。结果表明,不同亚基的蛋白质含量,湿面筋含量和干面筋含量存在明显差异,但上述品质性状的变异与亚基的品质评分值不相一致。Ｚｅｌｅｎｙ沉降值与亚基评分值相一致,且经方差分析,不同亚基的沉降值差异达到显著水平。     

晋麦92号低分子麦谷蛋白亚基Glu-A3基因鉴定

为鉴定强筋小麦品种晋麦92号低分子麦谷蛋白亚基Glu-A3基因,利用一套Glu-A3位点的特异低分子麦谷蛋白亚基STS分子标记引物,对晋麦92号及其亲本品种/系(晋麦33、临优6148)进行检测,该标记包含7对特异性引物,可快速、准确检测Glu-A3位点的7种等位变异类型(Glu-A3a/b/c/d/e/f/g),结果表明:晋麦92号含有Glu-A3c基因。由于Glu-A3c可影响面筋强度,可初步判断晋麦92号的强筋品质性状由Glu-A3c基因所决定。     

编码Glu-A3位点低分子量麦谷蛋白亚基的基因在山东小麦中的分布

低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）赋予面团延展性，对小麦加工品质有重要影响。本试验以545份山东小麦为材料，采用特异引物PCR技术对其Clu-A3位点低分子量麦谷蛋白的7个亚基基因进行了鉴定和分析。结果表明：地方品种中，g亚基的含量最丰富，达到52.3％，历史品种中，c、d亚基的含量较丰富，分别为47.0％和25.2％，与地方品种相比，历史品种中a、c、d亚基所占比例的提升幅度较大，而g亚基的比例则大幅减低。     

湖北地方小麦品种大头黄低分子量麦谷蛋白亚基基因的分子克隆

采用PCR方法从湖北地方小麦品种大头黄(ZM11217)中克隆得到1个低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)基因LMM-ZM11217.该基因具有LMW-GS基因的典型结构特征,编码区长度为870bp,编码288个氨基酸.推导的氨基酸序列比较结果表明,LMW-ZM11217与Glu-A3和Glu-D3位点控制的基因具有较高的相似性(最高相似性分别为82%和83%),而与Glu-B3位点控制的基因具有较低的相似性(最高相似性为74%).     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基组成与小麦品质的关系

小麦高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）与小麦加工品质尤其是烘烤品质密切相关，本文旨在对HMW-GS和小麦品质的关系进行初步探讨，明确HMW-GS对品质的具体作用。     

法国小麦种质高分子量麦谷蛋白亚基组成分析

为了解从法国引进的小麦种质的高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成,给小麦亲本选配提供参考依据,利用SDS-PAGE电泳对从法国引进的118份小麦种质进行了HMW-GS组成分析。结果表明,法国小麦种质材料在Glu-A1位点具有Null、1和2^＊三种亚基类型;在Glu-B1位点具有五种亚基类型,7、6＋8、7＋8、7＋9和17＋18;在Glu-D1位点具有四种亚基类型,2＋12、3＋12、4＋12和5＋10,其中优质亚基5＋10的频率为62.7％。共检测到32种HMW-GS组成类型,出现较多的是“Null,6＋8,5＋10”、“Null,7,5＋10”、“Null,17＋18,5＋10”和“Null,17＋18,2＋12”这四种组合类型,频率分别为11.0％、13.6％、11.9％和8.5％。法国小麦种质大多含有优质亚基,可作为亲本材料用于我国小麦的品质改良。     

麦谷蛋白亚基与小麦品质的关系研究进展

麦谷蛋白对小麦加工品质具有重要决定作用。高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）与低分子量麦谷蛋白亚基（LMW-GS）通过分子间二硫键形成麦谷蛋白聚合体,影响面团流变学特性。HMW-GS组成可作为品质育种中亲本选配和杂交后代选择的重要蛋白标记。由于LMW-GS基因拷贝数较多、分子量小,且在电泳图谱上与醇溶蛋白相互重叠,其与品质的关系研究远不及HMW-GS深入。从麦谷蛋白亚基的质和量两个层次包括HMW-GS组成与品质的关系、LMW-GS组成对品质的贡献大小、HMW-GS和LMW-GS的比例对品质的影响等全面综述了麦谷蛋白亚基与品质的关系,并对麦谷蛋白亚基在品质育种中的应用前景进行探讨,为HMW-GS和LMW-GS用于小麦品质改良提供理论基础。     

毕赤酵母工程菌原果胶酶的分离纯化

采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤和离子交换层析等方法,对毕赤酵母工程菌发酵液中的原果胶酶进行了分离纯化,测定了其分子质量,并确定了离子交换层析法的最佳离子交换条件。结果表明,硫酸铵的饱和度为70%时,可以使原果胶酶的回收率达到71.9%,比活力为1 096.35 U/m g;经Sephadex G 75凝胶过滤,原果胶酶回收率达到57.6%,酶的比活力提高到3 762.40 U/m g;最佳离子交换条件为:0~0.5 m o l/L N aC l(缓冲体系为N oA c-HA c,pH 5.8)溶液线性洗脱、Sepharose F ast F low离子交换层析分离,在该条件下酶的比活力提高到9 743.20 U/m g,纯度为粗酶液的18.91倍,达到了电泳级;SDS-PAGE电泳结果表明,其分子质量为43.17 ku。     

小麦LMW-GS基因PCR初步研究

用CTAB法提取小麦材料基因组DNA,根据基因库中公布的已知LMW-GS基因序列,设计并合成染色体位点特异的PCR引物1～7;探索出优化的PCR反应体系,即20μL反应体积中,Mg2+浓度为2.5mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,模板DNA30～60ng,每种引物50ng,Taq酶0.5U。利用特殊小麦材料——六倍体普通小麦(染色体组为AABBDD)、四倍体小麦(AABB)及二倍体一粒小麦(AA)和节节麦(DD)等的基因组DNA为模版,在优化的PCR反应体系下进行特异性扩增和引物验证。结果表明,引物3和引物4为小麦谷蛋白Glu-D3位点LMW-GS基因的特异引物,用其进行扩增时,循环反应条件为94℃变性1min,62℃退火1min,72℃延伸2min;扩增产物大小约为1.63kb,包括启动子和整个编码区。引物5和7为小麦谷蛋白Glu-B3位点LMW-GS基因的特异引物,用其进行扩增时,循环反应条件为94℃变性1min,64℃退火1min,72℃延伸2min;扩增产物大小约为1.45kb,包括启动子和整个编码区。     

鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达.转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

Secretive Expression of Insect Antifungal Peptide-Encoded Genes in Pichia pastoris and Activity Assay of the Products

The antifungal peptides, drosomycin （Drs） and its isoform drosomycin-like C （Drs-lC） from Drosophila melanogaster and Thanatin from Podisus maculiventris, have potent activity with broad spectrum against filamentous fungi. Secretive expression of these genes in yeasts makes it possible to utilize the supernatants of yeast culture as protective reagents on fruit, vegetable, food and other agricultural products. So the study of effective secretion by yeast expression system is of great importance. Three genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were cloned into pPICZαA and the recombinant vectors, pPICZαA-Drs, pPICZαA-Drs-lC, and pPICZαA-Thanatin were transformed into Pichia pastoris by the electric transfer method. The recombinant P. pastoris, which was screened by phenotype selection and PCR amplification, was induced to express antifungal peptide by methanol. The expressive products of the three recombinants showed antifungal activity against 5 out of 6 test fungi strains, and the products of Thanatin also had strong activity against the tested bacteria. The three antifungal peptide genes, Drs, Drs-lC, and Thanatin, were constructed into yeast P. pastoris. The expressed peptides were successfully secreted into the culture medium and exhibited potent activities against the test strains.     

斑点叉尾(鱼回)LEAP2成熟肽在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

LEAP-2 (Liver expressed antimicrobial peptide-2) 抗菌肽是一类主要在动物肝脏中表达的小分子肽,其生物学活性来自成熟肽区域,它们在动物的免疫系统中发挥了重要作用。本文以斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) LEAP-2成熟肽(mLEAP2)为研究对象,拟通过建立毕赤酵母表达系统,实现mLEAP2在毕赤酵母中的重组DNA表达,以期获得具生物学活性的重组体mLEAP2 (rmLEAP2),为进一步研究其功能和扩大制备奠定基础。首先以既有的斑点叉尾鮰mLEAP2的原核表达载体“pET-32a-mLEAP2”为模板,通过PCR扩增,获得5’端含EcoRⅠ酶切位点、3’端含NotⅠ酶切位点及6×his标签的LEAP-2成熟肽基因mLEAP2,然后将其与真核表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体“pPIC9K-mLEAP2”;电转化至毕赤酵母GS115细胞中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选,获得高拷贝酵母转化子;在29 ℃、250 r/m条件下,以0.5%的甲醇对其诱导表达120 h;采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,通过MALDI-TOF/TOF质谱对纯化产物的结构进行分析和鉴定。结果表明：表达的重组体蛋白为预期的目的蛋白rmLEAP2,其表达量约2.2 mg/L;另一方面,抑菌实验结果显示rmLEAP2具有明显的抑制枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在毕赤酵母中的表达

对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。     

Transferring a Gene Expression Cassette Lacking the Vector Backbone Sequences of the 1Ax1 High Molecular Weight Glutenin Subunit into Two Chinese Hexaploid Wheat Genotypes

1Ax1 high molecular weight glutenin subunit （HMW-GS） gene expression cassette （GEC） lacking vector backbone sequences together with selectable marker Bar GEC were co-transformed into Chinese hexaploid cultivars Een 1 and Emai 12 to test the feasibility and the efficiency of explant regeneration, transformation frequency and transgene expression comparing with whole vector transformation by the approaches of plasmid extraction and excision, immature embryo isolation, particle co-bombardment, tissue culture, DNA extraction, PCR amplification, southern hybridization, leaf-painting test and SDS-PAGE etc. No significant difference was shown in tissue culture response of the proportion of embryogenic calli, somatic embryogenesis and regeneration frequency between GEC and whole plasmid bombarded embryos, but both regenerated less well than non-bombarded control. Total 56 plantlets that survived PPT selection had insertion of at least the Bar gene, 18 were from the GEC treatment and 38 from the whole plasmid treatment, the escape ratio averaged 0.23. Six independent transplants f230 - f235 with GEC transformation from genotype Emai 12 presented clear PCR amplification bands of Bar and 1Ax1 gene. The transformation and co-transformation frequency were 3.51 and 100% respectively. PCR amplification using a primer-pair specific for ampicillin resistant gene indicated the existence of Amp^R gene in whole vectors but the removal in GECs and transplants. Southern blot of total DNA and PCR products from transgenic plants of 1Ax1 GEC confirmed the integration of the transgene 1Ax1 and the absence of the EcoR Ⅰ recognition site at both ends of the 1Ax1 GEC when integrated. SDS-PAGE showed the expression of 1Ax1 GEC and un-expression of whole plasmid. The length of integrated fragment, the proportion of the gene of interest （GOI） and the selectable marker （MG）, bombardment pressure and genotypes are vital for the expression of a transformed GEC.     

TaNHX1基因的组织特异性表达及生物信息学分析

液泡膜蛋白NHX与作物的耐盐、耐旱性紧密相关,其在作物改良中研究较多。通过分析耐旱小麦晋麦47号的NHX1基因表明,其编码的氨基酸序列具有11个跨膜结构,N末端位于膜外,而C末端位于膜内,这与第197位置保守的疏水丙氨酸变为苏氨酸密切相关;且与小麦NHX2有相对较远的进化关系。定量PCR分析表明,小麦中总NHX基因的表达具有组织特异性,根和叶中的表达丰度明显高于茎和穗,这一表达模式可能与植物在耐盐、耐旱过程中根和叶的生理功能相关;而根和叶中表达丰度的差异也可能与不同材料的耐旱性有关。     

烟曲霉植酸酶基因的克隆及在毕赤酵母的高效表达

根据文献报道的烟曲霉植酸酶序列，设计引物以烟曲霉CCTCCAF93044的总DNA为模板进行梯度PCR，扩增出了1条约1．4kh的带，将该片段进行DNA序列测定，其序列与已报道的烟曲霉植酸酶序列完全一致，但只编码完整的成熟植酸酶序列。将该片段克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达质粒pHBM108。该质粒转化毕赤酵母KM71所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，其中一重组子经144h诱导，植酸酶表达量至少为1．25mg／ml，比同类报道的表达量高出60％以上，以植酸钠为底物测得酶活为11．17U／ml。