药物单克隆抗体的制备及在药物分析中应用

概述了药物(含激素类药物)半抗原合成人工免疫原方法以及采用B-淋巴细胞杂交瘤技术制备药物单克隆抗体的要点，着重介绍了药物单克隆抗体作为几种免疫分析方法的核心试剂，在临床药理学研究及生物样品的药物残留分析中的应用，并对其进行了评述，以期了解药物单克隆抗体的应用现况及前景。     

干扰素单克隆抗体的研究进展

多功能细胞因子干扰素（IFN）是生物细胞受到适量的干扰素诱生剂刺激后所产生的一类微量的、具有高度生物学活性的糖蛋白,具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节及影响细胞分化等生物活性。与之相对应,抗IFN的单克隆抗体McAb作为一种重要的研究、检测IFN的手段,已被广泛应用于免疫机制研究、免疫功能检测、纯化IFN等领域。综述了各种IFN单克隆抗体、用途及其前景。     

O型口蹄疫单克隆抗体6H4株金标试纸条的制备

以制备的O型口蹄疫单克隆抗体为基础,结合免疫金技术,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,对6H4单克隆抗体进行标记,制备了该单克隆抗体的金标试纸条.研究结果表明,6H4单克隆抗体在pH 8.64下的稳定点为12 mg/L,可制备成金标记抗体及其反应膜.     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备抗三聚氰胺单克隆抗体,并对其效价、敏感性与特异性进行测定。[方法]通过三聚氰胺人工抗原MEL-BSA免疫BALB/c小鼠以及细胞融合等方法,获得分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用小鼠体内腹水诱生法制备抗三聚氰胺单克隆抗体;采用间接竞争ELISA法鉴定单克隆抗体的效价、敏感性与特异性。[结果]经小鼠免疫、细胞融合与亚克隆后获得了2株分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B12和2H9;间接ELISA检测结果显示,杂交瘤细胞1B12和2H9腹水型单抗的效价分别为1∶25 600与1∶12 800,IC50分别为8.0 ng/ml与8.3 ng/ml,且该2种单抗只与三聚氰胺有反应,与三聚氰胺类似物无交叉反应。[结论]该研究获得了高效价、高灵敏度的三聚氰胺特异性单克隆抗体,为后续研究提供了良好基础。     

植物病毒单克隆抗体研究的进展

一、概述 1975年Kohler和Milstein用骨髓瘤细胞与免疫的BALB/C鼠脾细胞融合,发现并证实其融合细胞能分泌抗免疫抗原的同质抗体,并以此建立了杂交瘤技术,这一技术上的突破在制备和应用抗体方面开创了新纪元。这种同质抗体被称为单克隆抗体,从第一个植物病毒单克隆抗体研究成功至1989年,世界上已制备出40多种不同植物病毒的单克     

抗MATSA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗鸡马立克氏病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surface antigen,MATSA)的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb),为马立克氏病的相关研究及研制以MATSA单克隆抗体为载体的抗肿瘤药物提供材料。【方法】用纯化的MATSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其染色体进行分析。将阳性杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠,制备McAb腹水,采用硫酸铵盐析法粗提McAb,并鉴定其所属亚类。【结果】获得了3株能稳定分泌MATSA McAb的杂交瘤细胞株B3、H6和D6,其培养上清液抗体效价为26~27,Balb/c小鼠接种细胞制得的腹水效价为210~211。染色体分析结果显示,3株杂交瘤细胞染色体数目均为52±2对。3株杂交瘤细胞株所分泌的McAb均为IgG 2b亚类,可与MSB1细胞反应。【结论】获得了MATSA的McAb。     

单克隆抗体制备的关键因素

单克隆抗体在实验室和临床上有广泛的应用,它是基础免疫研究、诊断测试和疫苗质量控制方面必要的研究工具。本文主要阐述了单克隆抗体生产中的关键步骤,特别是抗原的准备、细胞和动物的考虑(选择)、佐剂及复合物的制备、注射方式、细胞融合和腹水收集方法,以期在单抗制备过程中减少动物的痛苦,获得最佳的免疫反应。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

非鼠源性单克隆抗体技术及其在兽医学上的应用

单克隆抗体在生物学和医学领域显示了广阔的应用前景。非鼠源性单克隆抗体技术在兽医界更具有得天独厚的条件。本文仅对非鼠源性单克隆抗体的制备,淋巴细胞来源的选择,骨髓瘤融合配体的选择,免疫程序,体外免疫,腹水生产等问题进行简要的综述。     

牛结合珠蛋白α链单克隆抗体制备及辣根过氧化物酶标记

为了制备牛结合珠蛋白主要抗原区重组蛋白(pir Bo Hp)单克隆抗体及对其进行辣根过氧化物标记。试验利用纯化的pir Bo Hp作为免疫原,免疫雌性BALB/c小鼠,然后利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备Bo Hp单克隆抗体。通过Western blot试验分析制备的Bo Hp单克隆抗体的免疫反应性;利用抗体亚型鉴定试剂盒,分析鉴定Bo Hp单克隆抗体的亚型和轻链型。利用改良过碘酸钠标记法,对制备的Bo Hp单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。结果显示,试验成功制备了4株Bo Hp单克隆抗体,分别命名为1B3、6D6、6D3和6B7。Western blot结果显示,制备的4株Bo Hp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7能识别牛血浆中天然Bo Hp的α链。进一步抗体亚型鉴定结果表明,1B3、6D6、6D3和6B7抗体亚型均为Ig G1,轻链型为kappa链。利用改良过碘酸钠标记法,对纯化的Bo Hp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7成功进行了HRP标记。Bo Hpα链单克隆抗体的制备及其HRP标记为Bo Hp特异性诊断方法的建立奠定了基础。     

用人工合成多肽作为半抗原制备Bt Cry1Ac的单克隆抗体

为了制备Bt Cry1Ac特异性单克隆抗体(MAB),本试验从NCBI获得了Bt Cry1Ac蛋白的氨基酸序列,根据抗原性、亲水性和表位性分析选定Bt Cry1Ac特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白（KLH）免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞34株。通过ELISA和免疫印迹试验从中筛选出与Bt Cry1Ac天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株（6G9）。ELISA和免疫印迹试验结果显示,该克隆株所分泌的MAB能对合成肽和Bt Cry1Ac产生特异性反应,而与同源的Bt Cry1Aa、Bt Cry1Ab天然蛋白均无交叉反应。通过对转基因棉花的ELISA 检测结果表明,本试验所制备的Bt Cry1Ac单克隆抗体能够有效的区分常规棉和抗虫棉,并且能对其中的Bt Cry1Ac蛋白进行特异性的识别。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备

P46蛋白是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白,且与其他支原体无交叉反应,常作为猪肺炎支原体检测的靶蛋白。制备针对该蛋白的特异性单抗能为猪肺炎支原体的检测及机理研究提供有效的资源。本研究取猪肺炎支原体全菌抗原免疫小鼠,用大肠杆菌表达的P46蛋白作为筛选抗原制备了2株特异性单克隆抗体1A4和3C11。结果显示,2株单抗ELISA效价最高可达1∶64 000。Western-blot结果表明,2株单抗均能与原核表达的P46蛋白及猪肺炎支原体全菌蛋白中46 000大小的蛋白发生特异性反应;2株杂交瘤细胞株经3个月冻存或连续传代3个月均能保持较高的滴度。本研究成功制备了2株针对猪肺炎支原体P46蛋白的特异、稳定且高滴度的单克隆抗体。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备

以LF(牛乳铁蛋白)为抗原对BALB/C小鼠进行免疫,利用杂交瘤技术进行融合,制备了3株抗牛LF的杂交瘤细胞,并对其浓度、上清效价、腹水效价、抗体亚类、分泌单克隆抗体稳性定、单克隆抗体分子量等进行鉴定。结果表明,抗体分泌稳定,腹水效价达到106,间接ELISA、Western blot结果显示3株单抗均与FL发生特异性结合;Ig亚类鉴定均为IgG,且轻链均为K链。     

Effects of Monoclonal Antibody Against Porcine 40-kDa Adipocyte-Specific Membrane Protein on Endocrine Secretion in Pigs

The present study was to investigate the effect of monoclonal antibody against porcine 40-kDa adipocyte-specific membrane protein on endocrine secretion in pigs, in order to provide the evidence for application of this antibody to reduce excessive fat deposition in pig production. 40 Landrace×Saba pigs were randomly divided into 8 groups： 2 control groups were given saline with 10 mL, respectively, and the 6 treatment groups were given monoclonal antibody against porcine 40-kDa adipocyte-specific membrane protein with 0.1, 0.5, and 1.0 mg ·kg^-1 body weight at 15 or 60 kg body weight, respectively, all treatments were performed by intraperitoneal injection. The results showed that this monoclonal antibody could significantly reduce serum insulin level and increase levels of serum growth hormone （GH）, insulin-like growth factor-1（IGF-1）, triiodothyronine （T3）, and tetraiodothyronine （T4） either at 15 or 60 kg body weight injection. However, more marked effect was observed at 15 kg body weight treatment. Moreover, the dose-dependent effect of this monoclonal antibody on endocrine secretion was also observed. This result revealed that this monoclonal antibody increased secretion of hormones regulating fat lysis and reduced secretion of hormones regulating fat synthesis, suggests the reduction of porcine excessive fat deposition by this monoclonal antibody was carried out through affecting hormones regulating fat metabolism.     

提高细胞融合率和杂交瘤细胞过量生长的方法

B淋巴细胞促分裂素—鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,STM)细胞壁水溶性蛋白提取物的应用,以及延迟使用HAT的选择性培养基等条件的改进,使细胞融合率提高到90％以上。分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系阳性率提高到50％以上。并得到了不同类和亚类的单克隆抗体。本文也对某些影响杂交瘤细胞生长的因素和条件作了讨论。     

诺氟沙星ELISA试剂盒研制与性能鉴定

【目的】建立诺氟沙星（norfloxacin,Nor）免疫检测试剂盒。【方法】基于所制备的诺氟沙星单克隆抗体,通过矩阵法筛选最佳抗体工作浓度和二抗工作浓度,建立诺氟沙星间接竞争ELISA试剂盒（Nor-kit）,并对其性能进行了鉴定和确证。【结果】Nor-kit的平均IC50 为5.18 μg•L-1,灵敏度为0.31 μg•L-1,检测限为1.00 μg•L-1。试剂盒除了和诺氟沙星反应外,还和同系物中的培氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星及恶喹酸有不同程度的交叉反应。奶样中回收率平均为103.23%,变异系数(CV)为9.33%。3个不同批次试剂盒的测定结果中,批内变异系数小于10%,且批间变异系数也小于10%;在4℃保存条件下,试剂盒可以保存6个月而质量不变。奶样添加回收试验,试剂盒与LC-MS/MS测定结果没有显著差异（P≥0.05）;而且检测实际生产中鲜奶样时,试剂盒与LC-MS/MS测定结果也无显著差异（P≥0.05）。【结论】本研究成功研制出灵敏、特异、简便的诺氟沙星残留检测ELISA试剂盒。     

一种能用于三七品种及病害防卫反应分析的单克隆抗体（英文）

 在云南、广西大面积的三七栽培过程中三七常因镰刀菌侵染造成三七根腐病。2001年在分析比较健康及感染三七根腐病三七根的蛋白质图谱的基础上,为进一步研究三七抗根腐病品种的分子标记,本实验用健康及感染三七根腐病三七根样品的全蛋白质提取液进行了蛋白免疫印迹分析。单克隆抗体（Mab7）是由一种小鼠杂交细胞系(#490; ATTC HB-12029)针对Cronartium ribicola担孢子蛋白产生的抗体。它被鉴定为一种免疫蛋白I,能疹断不同地理范围内疱锈菌样品中70道尔顿热休克蛋白抗原(Cro r Ⅱ)。它被用于针叶树病原系统蛋白组学研究。本实验用单克隆抗体（Mab7）用分析了三七健康（主根、须根）及感病组织的蛋白免疫印迹。并用PDI quantity one 软件包详细分析了其蛋白印迹。Mab7在健康组织中在分子质量13.2～52.3 u之间显示出9条不同的免疫印迹谱带,其中分子质量25.5及26.4 u位置处出现两条比较强的谱带,在须根组织中只有在14.4道尔顿位置处出现一条谱带。在而在感病组织中显示更少的谱带,而且带型截然不同。用单克隆抗体（Mab7）监测组织中带型的变化有助于育种中抗病性的研究。进一步研究带型的变化与病害严重度之间的关系正在进行中。结果表明单克隆抗体Mab7作为免疫疹断工具可用于三七品种及病害防卫反应分析。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。