GFP基因在苜蓿转化组织中的荧光表达量分析

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农3号"紫花苜蓿(Medicago sativa)中,获得含有双元基因的紫花苜蓿转基因植株。在荧光显微镜下对不同处理、不同培养时期的苜蓿转化愈伤组织及再生转化植株进行荧光检测和荧光表达量的对比分析。结果表明:经预培养的转化愈伤组织中的荧光表达量明显高于未经预培养的转化子;3 d为共培养的最佳时间;侵染时经过摇床上摇动的负压处理,荧光表达量高于静止状态;共培养3 d后的转化荧光表达量达最强,随培养时间延长,表达量少量减少,但能够稳定表达。     

小鼠Dazl基因融合蛋白表达载体的构建及转染

根据NCBI数据库上公布的小鼠Dazl基因的mRNA序列设计引物,以小鼠睾丸组织RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠Dazl基因编码区片段,并将其克隆到增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中,构建重组融合蛋白表达载体pEGFP C1-Dazl,单双酶切和测序验证正确.将pEGFP-Cl-Dazl质粒转染293和NIH 3T3细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞质表达;对照组转染pEGFP-C1,绿色荧光遍布整个细胞.Dazl蛋白的免疫荧光试验也证明重组载体转染后,Dazl基因和GFP共同定位于胞质部分.pEGFP C1-Dazl融合蛋白表达载体的成功构建为进一步研究生殖特异性基因Dazl在小鼠和大型动物的表达特性奠定了一定的基础.     

绿色荧光蛋白基因在家蚕的表达研究

将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入家蚕蛹(G_0)的睾丸,利用荧光显微镜技术检测到绿色荧光蛋白基因在家蚕卵(G_1)表达的荧光图像。     

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗免疫对大鼠卵巢和生殖激素的影响

将50只大鼠随机分为5组,分别注射0.2（T1）、0.6（T2）、1g/L（T3）pEGISI,100μg空载体pEGFP-N1（C1）和100μL生理盐水（C2）,以探讨在没有使用免疫佐剂的情况下,抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI免疫对大鼠卵巢和生殖激素的影响。研究结果,加强免疫能提高抗体P/N值,T3组在加强免疫期与对照组差异显著（P〈0.05）;加强免疫第2周时T3组抗体阳性鼠比例达40%,与T1和T2组差异均显著（P〈0.05）。T3组卵巢大小和卵泡数均显著高于对照组（P〈0.05）,但抗体阳性鼠大卵泡数与阴性鼠差异不显著（P〉0.05）。各剂量组促卵泡素和雌二醇均高于对照组,且在加强免疫第2周时T3组与对照组差异显著（P〈0.05）;各剂量组孕酮含量与对照组差异均不显著（P〉0.05）。结果表明,在没有使用免疫佐剂的前提下,抑制素pEGISI基因免疫可产生抗体,促进卵巢发育和FSH分泌。本试验条件下100μg是最佳免疫剂量。     

GFP与GnRH/TRS融合基因表达载体的构建及表达

应用基因工程技术构建GnRH/TRS与绿色荧光蛋白的融合基因,核酸序列测定和Western boltting印迹分析基因表达;激光共聚焦荧光显微镜观察活细胞内荧光布局。结果融合基因获得了正确表达,GnRH/TRS-GFP融合基因的瞬间和稳定表达均获得了相同结果。GnRH/TRS-GFP融合蛋白具有绿色荧光蛋白的自发荧光特性,且不影响Gn-RH/TRS分子在细胞内的正确表达,为低促性腺激素性功能减退综合征治疗的进一步研究奠定了基础。     

鸡缺锌对含硫氨基酸代谢的影响

选用２日龄雏鸡,用含锌量低（２８ｍｇ／ｋｇ）的基础饲料饲喂１周后,分为基础饲料组、基础饲料＋锌组、基础饲料＋含硫氨基酸（ＳＡＡ）组、基础饲料＋锌＋ＳＡＡ组,研究了鸡缺锌对ＳＡＡ代谢的影响。结果表明,鸡缺锌时,其体内ＳＡＡ同化作用减弱,异化作用增强,导致血清无机硫（ＳＯ２－４）、粪尿总硫及无机硫（ＳＯ２－４）极显著增多（Ｐ＜０．０１）;缺锌鸡增重、血清锌含量、血清碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性极显著下降（Ｐ＜０．０１）,并表现较典型的临床缺锌症状。添加ＳＡＡ能促进鸡对锌的吸收和利用,使血清锌含量和血清ＡＫＰ活性提高（Ｐ＜０．０１）。     

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。     

蜘蛛丝蛋白的基因结构及其表达研究进展

蜘蛛丝的本质是蛋白质。由于蜘蛛牵引丝集合较高的抗张强度与弹性于一体，因此被许多研究人员看好．认为是一种难得的“生物钢”，并预言其在工农业生产及军事装备等领域具有广阔的应用前号。本文详细介绍了近年来蜘蛛丝蛋白的基因结构及其表达的研究进展。     

绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

拟构建绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ, ＧＦＰ）基因的真核表达载体 ｐｃＤＮＡ_３ＧＦＰ,并观察其在 ＭＤＣＫ细胞（大肾细胞系）中的表达。以Ｎｏｔ　Ⅰ切取ＧＦＰ后插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ_3,以ＢａｍＨⅠ鉴定方向,以ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ将ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ转染至培养的ＭＤＣ Ｋ,经Ｇ４１８筛选ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ阳性克隆,荧光显微镜下观察。结果证实成功构建了含ＧＦＰ ｃＤＮＡ的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＧＦＰ,并成功转染ＭＤＣＫ,在荧光显微镜下阳性克隆细胞呈绿色。 ＧＦＰ基因可在 ＭＤＣＫ细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记。     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus, rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体...     

绿色荧光蛋白在鸡胚成纤维细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pEGFP-C1转染到培养至第二代的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,同时使用活体DNA染料Hoechst3334(2H342)对CEF细胞核荧光染色,通过荧光倒置显微镜和RT-PCR方法检测GFP的表达产物。在荧光倒置显微镜下可见CEF的胞质和核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质,在H342作用下,细胞核呈现蓝色荧光;转染细胞中转录产物经RT-PCR扩增后,在凝胶上可见与GFP基因片段分子量大小一致的条带。可见,GFP基因可以被转染至CEF中,并在CEF中表达。     

利用绿色荧光蛋白报告基因筛选植物乳杆菌强启动子

[目的] 结合已知植物乳杆菌启动子和绿色荧光蛋白报告基因,筛选能够进行稳定强表达的启动子,为构建植物乳杆菌高效特异表达载体提供基因元件。[方法] 分别合成已知植物乳杆菌启动子P11、Pefp、Ptuf33和Ptuf34及其下游绿色荧光蛋白报告基因,并使用上述合成序列分别替代pMG36e乳酸菌表达载体原有多克隆位点及其上游启动子部分,形成启动子筛选载体。利用电转方法将成功构建的启动子筛选载体转化至植物乳杆菌,通过检测重组子绿色荧光信号强弱对比分析启动子强弱特性。[结果] 4个启动子中转录延伸因子TU基因启动子Ptuf33和Ptuf34在受体植物乳杆菌中表达目的基因水平显著（P<0.05）高于其他启动子。[结论] 结合该研究结果及相关报道可知,启动子Ptuf33和Ptuf34在植物乳杆菌中普遍高表达,可以为后续高表达植物乳杆菌载体构建提供元件。     

桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析

桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。     

利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。     

表达绿色荧光蛋白的鸭肠炎病毒gE基因转移载体构建

本实验利用PCR方法扩增DEVC-KCE株gE基因片段(包含gI基因及其侧翼序列),扩增产物克隆入pGEM-T载体测序后亚克隆至pUC19 EcoRI、SalI位点间,获得pUC-gE。将增强型绿色荧光蛋白表达盒插入pUC-gE BamHI位点,构建转移载体pUC-gE-EGFP。该转移载体有7个单一酶切位点可供外源基因插入,上下游侧翼分别为1.57Kb和1Kb。将转移载体pUC-gE-EGFP转染鸭胚成纤维细胞(DEF),观察到绿色荧光,说明EGFP基因获得有效表达,为开发以鸭肠炎病毒为载体的多价、多联基因工程疫苗提供了物质基础。     

桑树低温诱导基因Wap25的序列分析及表达产物的亚细胞定位

Wap25是从桑树幼茎克隆的低温诱导蛋白基因,为胚胎后期富集蛋白(LEA)基因的成员之一,与其它物种低温诱导基因的同源性很低。生物信息学分析表明,桑树低温诱导基因Wap25编码蛋白由226个氨基酸组成,分子质量25.3kD,等电点5.52;蛋白N端1-30位氨基酸表现出强烈的疏水性,其后是亲水性高的区域,平均亲水值达-1.020,而蛋白1-29位氨基酸为典型的真核生物蛋白质的信号肽序列,表明WAP25蛋白属于分泌型蛋白。用SubLocv1.0软件预测WAP25的亚细胞定位,将该蛋白定位于细胞质中。Tmpred软件预测WAP25不存在跨膜结构。构建Wap25与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,用基因枪法将其转入洋葱表皮细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下发现GFP分散于洋葱表皮的细胞质中,而在细胞核未发现GFP的表达,此结果与WAP25的亚细胞定位预测结果相符。