江汉平原一规模化猪场暴发伪狂犬病的调查研究（Ⅲ）

应用细胞培养病毒蚀斑技术，将分离的伪狂犬病毒ＨＳ－９３０４株在鸡胚成纤维细胞单层培养上覆以营养琼脂培养基，连续挑斑纯化３次，成功地获得了纯化病毒克隆株。对病毒克隆株在传代细胞上复壮增殖后进行毒价测定，接种试验动物人工造病并进行血清中和试验以及外源性污染的检定。     

江汉平原一规模化猪场暴发伪狂犬病的调查研究：Ⅱ,病毒血清中和试验

应用伪狂犬病毒(PrV)阳性参照血清与分离的病毒株HS—9304进行小鼠病毒血清中和试验和IBRS—2细胞培养中和试验时,PrV阳性参照血清可完全中和HS—9304毒株对小鼠的致病力及对猪肾传代细胞系的致细胞病变作用(CPE),这进一步证实了家兔生物学试验的诊断结果,从病死猪大脑及实质器官分离出的HS—9304确系PrV。     

乙型脑炎病毒HW_1克隆纯化株的鉴定及外源性污染的检定

应用病毒蚀斑技术，将乙型脑炎病毒（ＪＥＶ）ＨＷ１株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）单层培养上连续挑斑纯化３次，对纯化后的克隆株进行血清学、免疫生物学鉴定及外源性污染检定。毒株对ＢＨＫ－２１细胞感染滴度≥１０６．１５ＴＣＩＤ５０；对８～９ｇ小鼠脑内感染的毒力≥１０７．１０ＬＤ５０／０．０４ｍＬ；与ＪＥＶＰ３株阳性参考血清的中和指数≥２０００；克隆株对猪有较好的免疫原性，无外源性污染。     

乙型脑炎病毒HW1克隆纯化株的鉴定及外源性污染的鉴定

应用病毒蚀斑技术，将乙型脑炎病毒ＨＷ１株在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）单层培养上连续挑斑纯化３次，对纯化后的克隆株进行血清学，免疫生物学鉴定及外源性污染检定。毒株对ＢＨＤ－２１细胞感染滴度≥１０＾６．１５ＴＣＩＤ５０；对８－９ｇ小鼠脑内感染的毒力≥１０＾７．１０ＬＤ５０／０．０４ｍＬ；与ＪＥＶＰ３株阳性参考血清的中和指数≥２０００；克隆株对猪有较好的的性，无外源性污染。     

猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定与生物学特性研究

从黑龙江省大庆市某猪场采集流产的仔猪脑组织、扁桃体等病料接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,用PCR法、血清中和试验及直接免疫荧光法等方法进行鉴定,并对病毒滴度、对兔和15日龄仔猪的致病力、对热、胰蛋白酶、氯仿以及乙醚的敏感性等生物学特性进行测定.结果表明:PCR法能扩增出217 bp的基因片段,与预期目的条带一致;病毒能被伪狂犬病毒阳性血清所中和,直接免疫荧光法结果呈阳性;经克隆纯化后测定其病毒滴度为107.36 TCID50/0.1 mL,对兔和15日龄仔猪有较强的致病力,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感.鉴定结果表明,该病毒为猪伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株.     

伪狂犬病病毒分子致病机理的研究进展

最近几年,对于伪狂犬病毒病(PrV)蛋白功能分子基础的认识有了重大进展.这些进展的主要方面是对病毒囊膜糖蛋白和细胞上病毒受体进行了鉴定和功能描述;对形成神经毒力的蛋白质和神经病理机理进行了阐明;对现有的致弱突变株和经突变而成功致弱的活疫苗进行了检测和描述;对PrV DNA基因组的序列测定也接近完成.本文是在匈牙利布达佩斯伪狂犬病(AD)专题讨论会上的一篇综述的一部分.     

猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定和生物学特性的研究

从黑龙江大庆某猪场采集流产死亡的仔猪大脑、扁桃体等病料组织接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,经PCR检测、直接荧光法检测,血清中和试验,证实分离到的病毒为伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株,该病毒经克隆纯化后测得其毒价为108.36TCID50/ml,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感,15日龄哺乳仔猪接种该分离株后发病死亡。     

NDV La Sota株三个病毒克隆株间生物学特性的比较研究

为比较新城疫病毒(NDV)La Sota株不同克隆株之间的生物学特性,本研究通过挑取细胞病变区对LaSota株病毒进行纯化,并获得了3个病毒克隆株。通过血凝素热稳定性试验、病毒复制动力学试验和免疫原性试验,对3个病毒克隆株进行分析比较。结果显示,不同的病毒克隆株间在这些生物学特性上存在着不同程度的差异,表明为了获得性质均一、稳定的病毒,有必要进行病毒的纯化,并根据实验目的进行比较取舍。     

猪伪狂犬状病毒S1株的分离与鉴定

从上海事某猪场发效仔猪体内分离到1株病毒，该毒株能在鸡胚成纤维细胞，RK，Vero,BHK21,ST,PK15细胞上增殖并产生细胞病变，通过蚀斑克隆对其进行纯化，克隆毒株在BHK21细胞上的TCID50为50μL10^-6.68稀释液，该病毒能被伪狂犬病毒（PRV）阳性血清中和，接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察可见直径110－180nm的典型疱疹病毒粒子，用该病毒接种兔仔猪均出现典型的伪狂犬病症状，表明该分离毒株为PRV。     

抗猪传染性胃肠炎病毒重组S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法3次克隆,获得2株稳定分泌抗TGEV重组S蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为C7C882和B5G8G7,其染色体平均计数均为88±10对,制备腹水抗体效价分别为1:2×105和1:104,分泌抗体亚类均为IgM型.2株杂交瘤细胞上清与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪伪狂犬病病毒(PrV)均无交叉反应,与TGEV感染细胞经间接免疫荧光检测均呈黄绿色荧光.     

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol·L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达.通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性.以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原的最佳包被量为3.74 μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50.用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%.     

猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研...     

猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。     

犬冠状病毒YS1株在DK细胞上蚀斑形成方法的建立及其克隆纯化

犬冠状病毒 ( CCV)是引起犬发生冠状病毒性肠炎的一种重要病原 ,由于该病毒在普通细胞上培养需较长时间 ( 3～ 6天 )才出现病变 ,且病变不明显 ,不易观察 ,难以广泛开展该病毒的鉴定、克隆、滴定及中和抗体的检测等研究工作。本实验以琼脂糖作为覆盖物 ,在 DK细胞上 ,对该病毒蚀斑的形成条件进行了摸索 ,建立了犬冠状病毒的蚀斑形成方法 ,并以该方法进行了 CCV YS1株的克隆纯化 ,结果较为理想 ,现报告如下。1　材料与方法1 .1　病毒株　犬冠状病毒 YS1株 ,从 CCV肠炎犬病料中分离获得 ,人工感染犬试验 [1]表明其为一株免疫原性良好的…     

鸡传染性法氏囊病毒蚀斑克隆纯化CV01株生物学特性研究

通过蚀斑克隆技术,对野外分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行纯化后,筛选到1株病毒含量高、传代稳定的蚀斑纯化毒CV01株。生物学特性分析发现,IBDV能在鸡胚成纤维细胞(DF-1)上形成大小不同的蚀斑,且蚀斑大小与病毒的毒力有一定的相关性,大蚀斑的病毒含量高(108.0TCID50/m L以上),小蚀斑的病毒含量低(107.0l~108.0TCID50/m L)。蚀斑克隆VP2基因序列分析显示大蚀斑克隆毒具有IBDV超强毒株的特性。选病毒含量高(108.5TCID50/m L)的大蚀斑CV01进行进一步试验,结果发现CV01对10日龄SPF鸡胚的毒力达到106.7/0.2 m L以上,能致40%的30日龄SPF鸡感染。蚀斑克隆毒的免疫原性好,血清中和抗体水平高达15.6 log2,能100%抵抗超强毒株的攻击,表明该纯化株适合用于疫苗生产。     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中,经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染,采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养,经蚀斑克隆纯化,培育1株细胞培养适应毒,命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代,能够产生典型的细胞病变,病毒滴度随代次显著增加,第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观,无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm,有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因,其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明,PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

株血清学和免疫学特性的研究

 在鸡胚肾细胞上对HN₉₉株病毒进行了克隆纯化，经检测无外源病原污染。应用血清交叉中和试验确定了IBV HN₉₉株的血清型，并用免疫保护试验进行了验证，结果证明HN₉₉株与T株属同一血清型，与TJ、SD、湖北等地方分离株有一定的相关性。不同免疫剂量的效力试验结果表明用0.2 ml剂量的HN₉₉灭活苗接种试验鸡，能够对HN₉₉攻毒提供100%的保护，证明HN₉₉株具有良好的免疫原性。     

猪伪狂犬病病毒新W株的分离与鉴定

从新疆五家渠、石河子某猪场病死仔猪的大脑和内脏组织中分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒 ( PRV)毒株 ,通过兔体接种、BHK-2 1细胞培养、理化特性测定、中和试验、实验兔和仔猪回归试验、电镜观察、PCR扩增及感染力测定 ,分离的病毒接种实验兔后发生奇痒并麻痹致死 ;BHK-2 1细胞培养盲传 4代出现典型细胞病变 ;电镜观察可见病毒粒子呈圆形并带有囊膜和纤突 ;回归兔出现典型奇痒症状 ,仔猪出现典型的症状和病理变化 ;分离的病毒能被 PR鄂 A株标准阳性血清中和 ;该病毒对氯仿、乙醚、酸、热敏感 ;PCR体外扩增可见其与鄂 A株在同一水平位置上有相同的电泳带 ;用 BHK-2 1细胞测定其毒价 TCID50 为 10 -1 0 .87/0 .1m L 根据此分离病毒株的上述特性 ,鉴定其为伪狂犬病病毒     

表达日本乙型脑炎病毒E蛋白重组伪狂犬病病毒SA215（E）的构建

将日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)CQRC-1株的E基因通过RT-PCR产生,克隆到pMD18-T simple载体中,再亚克隆到转移载体pPI-2,EGFP中,命名为PPE.PPE质粒和伪狂犬病毒(PRV)SA215株DNA通过磷酸钙共转染方法转染到Vero细胞上.通过有限稀释法、噬斑纯化、PCR检测、Southern杂交、West杂交,获得了表达JEV E蛋白的重组伪狂犬病病毒,命名为SA215(E).结果表明,SA215(E)在生长曲线、噬斑形态及大小、在Vero细胞上的病变与PRV SA215一致.安全性试验表明,SA215(E)对小鼠和兔具有较高的安全性,SA215(E)具有很强的免疫原性.接种兔能预防致死剂量的PRV Fa肌肉内攻毒;接种小鼠能预防致死剂量的JEV cQRC-1株腹膜内攻毒.表明该重组病毒是养猪业控制伪狂犬病和乙脑最适合的候选疫苗株之一.