新疆部分地区屠宰场羊源细粒棘球蚴分子鉴定及其遗传多样性分析

[目的]了解新疆维吾尔自治区部分规模化屠宰场羊的细粒棘球蚴感染情况及其分子遗传特征。[方法]收集屠宰场羊肝脏组织内经肉眼观察鉴定为细粒棘球蚴的包囊样本96份,全部提取基因组DNA后,基于细粒棘球绦虫cox1基因位点和nad1基因位点进行PCR扩增和测序。通过序列比对数据鉴定其基因型,构建遗传进化树解析其分子遗传特征。[结果]在cox1基因位点上,有81份样本呈PCR扩增阳性（84.37%,81/96）,经序列分析鉴定,所有阳性样本均为细粒棘球蚴G1基因型（n=81）,存在15个单倍型（Hap＿1～15）;在nad1基因位点上,有67份样本呈PCR扩增阳性69.79%(67/96),经序列分析鉴定出2种基因型,分别为细粒棘球蚴G1基因型（n=66）和G3基因型（n=1）,存在19个单倍型（Hap＿1～19）。种系发育分析显示,获得的细粒棘球蚴G1基因型和G3基因型序列,与国内外已报道的多种宿主源的G1基因型和G3基因型序列均处于同一个进化支。[结论]新疆部分地区羊源细粒棘球蚴呈现遗传多样性分布特征,研究结果为该地区羊包虫病的防治提供了基础数据。     

西藏牦牛、绵羊棘球蚴病病原的分子鉴定

本研究旨在对西藏自治区那曲地区和拉萨市牦牛、绵羊体内棘球蚴病原进行分子生物学鉴定并分析其遗传变异规律。对2016年11月底采自西藏拉萨市当雄县和那曲地区嘉黎县的5只绵羊体内的5个棘球蚴包囊、15头牦牛体内的18个棘球蚴包囊分别分离棘球蚴原头蚴或生发层组织，提取基因组DNA，应用PCR方法扩增nad1基因，通过测序获得nad1全基因序列。运用DNAStar MegAlign软件对序列进行同源性分析。以GenBank中已公布的棘球属的nad1全基因序列为比对对象，采用最大似然法（ML）构建系统发育树。结果显示，所测定的牦牛和绵羊的23个棘球蚴病原nad1基因序列与GenBank登录的细粒棘球蚴狭义种（G1基因型）nad1基因序列高度同源，同源性为99.6%~99.8%，23条nad1基因的遗传距离为0~0.0022447。同源基因的碱基变异率为0.2%~0.4%；与棘球属其他棘球绦虫同源基因的碱基变异率为14.9%~19.8%。有5个样本的nad1基因在不同位点发生碱基突变，变异位点发生序列转换。以上结果表明，本研究所采集牦牛和绵羊的棘球蚴为细粒棘球绦虫G1基因型，其nad1基因变异小，序列一致性高。     

新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因分型研究

为了探明新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型,根据GenBank公布的12S rRNA基因和CO1基因分别设计特异性引物,对58个绵羊细粒棘球蚴包囊进行PCR检测,再通过CO1特异性引物对检测阳性病料进行PCR扩增、测序及基因分型。通过12SrRNA基因检测发现58份样品均为阳性;对所测得的58条CO1基因序列分析,发现新疆塔城地区绵羊细粒棘球蚴流行株基因型均为G1型,且CO1基因序列存在多态性,为塔城地区绵羊细粒棘球蚴病的防控提供了科学依据。     

羊细粒棘球蚴病抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在通过建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.作者利用DNAStar软件对GenBank上发表的细粒棘球蚴EG95蛋白的氨基酸序列进行分析,筛选出高度亲水的优势表位区EG95s,对该区域编码基因进行克隆并表达.以纯化的重组融合蛋白为包被抗原,按常规方法建立检测羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA,并对各种条件进行优化.SDS-PAGE结果表明成功获得了可溶性好、表达效率高、纯化简便的重组融合蛋白GST-1EG95s和HIS-1EG95s,Western blot检测结果表明表达产物具有较好的反应原性.间接ELISA方法优化结果显示:HIS-1EG95s作为包被抗原效果优于GST-1EG95s.经统计学分析,确定间接ELISA方法的判定标准:OD450nm值≥0.235时判定为阳性,OD450nm值≤0.191时判定为阴性,介于二者之间则为可疑.分别对采自新疆的70份羊包虫阳性血清和70份阴性血清进行检测,结果表明该方法与新西兰Wallaceville动物研究中心提供的间接ELISA方法符合率为100%,阻断试验结果显示与其他蛋白无交叉反应,批内变异系数介于3.8%～5.6%,批间变异系数介于5.7%～8.5%,结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好.作者所建立的羊细粒棘球蚴病抗体的间接ELISA检测方法有望为羊细粒棘球蚴病的检测提供快速、简便的手段.     

细粒棘球绦虫TPx基因的克隆及序列分析

从自然感染病羊肝内收集细粒棘球绦虫（Eg）原头蚴,分别提取总RNA和基因组DNA。根据GenBank数据库中的细粒棘球绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶（EgTPx）基因序列设计1对引物,以总RNA为模板,采用RT—PCR技术扩增出EgTPx基因片段,同时以基因组DNA为模板扩增出对应的基因组序列。PCR产物经纯化后连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5口后,进行序列测定和生物信息学分析。结果表明,成功扩增到中国青海株细粒棘球绦虫EgTPx基因片段,其开放阅读框为582bp,编码193个氨基酸,与已知的EgTPx基因核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的同源性均为99％,有3个碱基发生变异,分别在245,306,318位由C变为T;引起1个氨基酸变异,由Ala^82变为Val^82。EgTPx具有典型的2-Cys型过氧化物氧还蛋白催化性位点Cys^48和Cys^169。,以及周围保守的FVCP和VCPA序列。EgTPx基因的开放阅读框对应的基因组序列包含2个外显子和1个69bp的内含子。     

细粒棘球蚴SmadA基因的克隆及其功能的初步鉴定

本研究旨在克隆细粒棘球蚴Smad蛋白家族基因EgSmadA,鉴定其结构及表达部位,并建立酵母双杂交体系.利用生物信息学方法,克隆及分析EgSmadA基因的DNA全长序列,采用免疫组化技术鉴定EgSmadA蛋白的表达及分布,并构建该基因酵母双杂交载体.结果表明,成功扩增出EgSmadA基因组序列全长4 069 bp,包含4个外显子和3个内含子,开放阅读框为957 bp,编码318个氨基酸,该蛋白C端含有Smad蛋白家族进化高度保守的典型结构域MH2 (Mad homology),并成功构建该基因及其MH2结构域的酵母双杂交载体.免疫组化定位该蛋白主要表达于原头蚴被膜及囊泡生发层.研究结果为进一步研究EgSmadA在细粒棘球蚴生长发育中的作用奠定了基础.     

甘南州玛曲县棘珠蚴病流行病学调查

通过对玛曲县欧拉、尼玛等乡牧场棘球蚴病高发区牛15头、羊100只、犬15条剖检和分析发现，棘球蚴感染率牦牛为66．67％、羊为50％、母羊为75％，母犬细粒棘球绦虫的感染率为27％、人的棘球蚴感染率为0．3％。对1～5岁绵羊各50只，进行的间接血凝感染抗体检测表明：1岁羊血清滴度较低，2岁和4岁羊的滴度较高，而3岁和5岁羊的滴度略低于前一年龄组。酶联免疫吸附试验结果：1岁羊血清平均值最低，2岁最高，以后各年龄组略微降低，并大致保持平稳状态。     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT—PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA，并亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上，转化至大肠埃希氏菌BL21，用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明，从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA，序列长度为481bp，包括471bp的开放阅读框，与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致；SDS-PAGE电泳结果显示，重组表达质粒产生了约42ku的目的带，其中EG95蛋白质的分子质量约为15．2ku，与预期结果一致；Western-blotting试验检测表明，融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示，EG95基因高度保守，所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

棘球蚴对骆驼胚胎的感染

棘球蚴病是由细粒棘球绦虫的幼虫 (棘球蚴 )寄生在一些哺乳动物 (中间宿主 )体内而引起。本病遍布全球 ,在单峰驼中呈高水平的地方性流行 ,在流行地区 ,单峰驼是中间宿主。据报道 ,本病在单峰驼中的感染率为 1 7%～ 80 % ,在绵羊中的感染率为 1 .3%～ 2 0 %。细粒棘球绦虫在家畜体内一般有一个完整的生活周期 ,但在单峰驼体内这样一个周期却很少能够维持 ,因为 EIBiharl( 1 985 )证实 ,从感染的骆驼体内分离到的大部分是不育囊 (无原头蚴的囊 )。中间宿主可在出生后 ,采食或饮用含有细粒棘球绦虫虫卵的食肉目动物(终末宿主 )粪便污染的饲…     

我国三省区细粒棘球绦虫基因的变异分析

对从青海省、甘肃省和新疆维吾尔族自治区采集的24株细粒棘球蚴，用线粒体DNA的CO1基因和ND1基因结合rDNA的ITS2测序，调查了不同地区分离株基因型的变异情况。结果显示，所有分离株均为普通羊株(G1基因型)；CO1基因序列的变异率为0～0．8％，ND1基因的变异率为0．1％～0．7％；青海分离株ITS2序列的变异率为0．4％～3．1％；2株青海省西宁市和1株甘肃省武威市分离株分剐在C01基因和ND1基因序列不同位点发生的1处核苷酸非同义替换，导致1个编码的氨基酸替代。研究表明，我国上述3省、区部分区域存在的细粒棘球蚴属于同一株(G1基因型)。     

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究.以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析.ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Westem blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原.筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1～2kb之间.对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%.筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因.     

海晏县棘球蚴病流行病学调查及综合防治报告

１９９１年９一１１月在海晏县进行棘球蚴病流行病学调查，剖检绵羊２２３０只，感染率平均８７．０４％，剖检牦牛１０４０头，感染率平均８０．５８％，剖检犬１１条，细粒棘球绦虫感染率为６３．６４％，确认海晏县是犬棘球绦虫感染和家畜棘球蚴病的高发区。并于１９９１年１１月至１９９３年１１月在全县境内进行了棘球蚴病综合防治。采取“犬犬投药，月月驱虫”为主的综合防治措施后，犬细粒棘球绦虫感染率下降到零，２岁羊棘球蚴感染率由防治前的５６．９３％下降到２１．６２％，１岁羔羊由防治前的４７．５０％下降到１３．２８％，两年来的综合防治效果十分显著。     

细粒棘球绦虫基因型与抗原研究进展

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,坛）是一种重要的人兽共惠寄生虫。现已报道细粒棘球绦虫有10个基因型（G1～G10）,我国仅发现G1和G6。细粒棘球绦虫六钩蚴阶段的Eg95,原头蚴阶段的EgFABP,成虫阶段的EgM9和Eg31分别被认为是最有前途的用于免疫保护的抗原。其中Eg95基因工程疫苗已经商业化生产,对羊免疫保护率达到了95％以上。     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础.将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定.同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测.结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性.同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性.EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础.     

西藏牦牛、绵羊棘球蚴病病原的分子鉴定

本研究旨在对西藏自治区那曲地区和拉萨市牦牛、绵羊体内棘球蚴病原进行分子生物学鉴定并分析其遗传变异规律。对2016年11月底采自西藏拉萨市当雄县和那曲地区嘉黎县的5只绵羊体内的5个棘球蚴包囊、15头牦牛体内的18个棘球蚴包囊分别分离棘球蚴原头蚴或生发层组织,提取基因组DNA,应用PCR方法扩增nad1基因,通过测序获得nad1全基因序列。运用DNAStar MegAlign软件对序列进行同源性分析。以GenBank中已公布的棘球属的nad1全基因序列为比对对象,采用最大似然法(ML)构建系统发育树。结果显示,所测定的牦牛和绵羊的23个棘球蚴病原nad1基因序列与GenBank登录的细粒棘球蚴狭义种(G1基因型)nad1基因序列高度同源,同源性为99.6%～99.8%,23条nad1基因的遗传距离为0～0.0022447。同源基因的碱基变异率为0.2%～0.4%;与棘球属其他棘球绦虫同源基因的碱基变异率为14.9%～19.8%。有5个样本的nad1基因在不同位点发生碱基突变,变异位点发生序列转换。以上结果表明,本研究所采集牦牛和绵羊的棘球蚴为细粒棘球绦虫G1基因型,其nad1基因变异小,序列一致性高。     

同心县羊包虫病发病情况调查及其防治

羊包虫病包括多头蚴和棘球蚴。多头蚴俗称脑包虫，是多头绦虫的幼虫，寄生于羊脑内；棘球蚴是细粒棘球绦虫的幼虫，包括无头棘球蚴、人型棘球蚴及多房棘球蚴，主要寄生于羊的肝脏、肺脏，人亦可感染。多头蚴与棘球蚴的成虫寄生于犬、狼、狐狸等终未宿主的小肠内，其孕卵体节脱落后，随粪便到体外。     

青海省牛、羊棘球蚴病流行病学调查

为了解青海省家畜棘球蚴病流行现状,给防治工作提供科学依据,2011年,在不同自然环境条件下选择5个县(市)对牛、羊棘球蚴病进行了流行病学调查.结果表明,5县牛、羊棘球蚴平均感染率和感染强度分别为27.09％、33.89％和0.5、1.3,犬细粒棘球绦虫平均阳性率为10.91％.     

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95- (C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132 ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。     

甘南州玛曲县棘球蚴病流行病学调查

通过对玛曲县欧拉、尼玛等乡牧场棘球蚴病高发区牛15头、羊100只、犬15条剖检和分析发现,棘球蚴感染率牦牛为66.67%、羊为50%、母羊为75%,母犬细粒棘球绦虫的感染率为27%、人的棘球蚴感染率为0.3%.对1～5岁绵羊各50只,进行的间接血凝感染抗体检测表明:1岁羊血清滴度较低,2岁和4岁羊的滴度较高,而3岁和5岁羊的滴度略低于前一年龄组.酶联免疫吸附试验结果:1岁羊血清平均值最低,2岁最高,以后各年龄组略微降低,并大致保持平稳状态.     

细粒棘球蚴细胞系（13G—5）细胞代谢抗原的免疫性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系（１３Ｇ－５）细胞的天然代谢抗原，接种昆明小鼠，于接种后第１４天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约１０００个，于２００天剖检观察有无包囊形成，病理切片鉴定；并用该抗原作为诊断怕，使用间接血凝（ＩＨＡ）、琼脂扩散（ＡＧＤ）试验，检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清，以多房棘球细病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明，该抗原能使６０％的小鼠获工抗细粒棘