禽流感病毒分离株A／Chicken／Wangcheng／4／2001（H9N2）核蛋白基因（NP）的克隆和序列分析

用无特定病原体(SPF)鸡胚增殖禽流感鸡体分离株A／Chicken／Wangcheng／4／2001(H9N2)(WC2001)，提取病毒总RNA。根据已发表的A型流感病毒株NP基因序列，设计—对引物，运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增该病毒分离株的NP基因，克隆后进行序列测定。序列分析表明，扩增的NP基因为相应的开放阅读框架。WC2001株NP基因序列与数株A型流感病毒NP序列进行比较，相互间同源性在80％左右，其中与A／Duck／Hong Kong／Y280／97(H9N2)有很高的同源性，而与人流感病毒株和猪流感病毒株差异较大，显示禽流感病毒特征。     

一株禽流感病毒全基因的序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18-T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株各个基因的相应序列进行比较分析:Duck/HongKong/Y280/97(DHKY280/97)、Duck/HongKong/YT439/97(DHKY439/97)、Quail/HongKong/G1/97(QHKG1/97)、A/Chicken/Beijing/1/94(CBJ1/94)、Chicken/HongKong/G9/97(CHKG9/97)、A/Turkey/California1/66(TC/1/66).结果表明:我们克隆到的TW1/66株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:TW1/66的各基因与TC/1/66株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有(67.4%).与其它各毒株各基因同源性均较低,但与DHKY439/97各基因同源性高于与DHKY280/97、QHKG1/97、CBJ1/94、CHKG9/97各基因同源性.     

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

根据NDV NP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物，利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段，将该片段克隆到pMD18-T Vector上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子。为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性，采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定，获得了F48E9株NP基因片段的基因序列，利用DNASIS分析软件，将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较，其核苷酸序列同源性为88.2%。至此，我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆。     

禽流感病毒A/goose/China/24/96(H7N3)分离株NP基因片段的克隆及其序列同源性分析

本文首次以广东禽流感无致病力分离株A/goose/China/24/96（H7N3）核蛋白（NP）基因核酸为模板，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR）技术，扩增出了预计的830bp左右的片段。将此扩增产物在克隆进pEGM-4Z载体，采用限制性内切酶、地高辛标记探针和序列测定对该重组质粒进行了鉴定。测出的NP序列经 Blast2.0比较，与GenBank中收录的AIV其它病毒株NP基因相应片段的同源性在91%以上。     

禽流感病毒H9N2亚型分离株HA基因的克隆及序列分析

以禽流感病毒地方株A/chicken/Mudanjiang/ 0 82 3/ 2 0 0 0 (H9N2 )的总RNA为模板 ,用通用反转录引物和自行设计的一对特异性引物 ,采用RT PCR方法扩增了HA基因。测序及序列分析结果表明 :HA基因全长 1 70 7bp ,编码 560个氨基酸残基 ,与GenBank收录的H9N2亚型的核苷酸同源性最高达 99% ,最低为 87 2 3 % ;氨基酸同源性最大达 98 0 4 % ,最低为 88 57%。经HA裂解位点附近的氨基酸序列分析表明 ,CMJ/ 0 0毒株为低致病力毒株     

HSN1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增，将获得的PCR产物分别与T载体连接，获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示，分离毒株间的核苷酸同源率为90．2％～98．7％，氨基酸同源率为82．6％～97．8％。与其他毒株比较A／Goose／HLJ／P46／2003(H5N1)和A／Goose／HLJ／G2／2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失；A／Goose／Jilin／W2／2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T／C突变，成为终止密码子，造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在；H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒株HA基因的克隆与序列分析

本研究对1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行了扩增、克隆及序列测定。结果表明：所扩增的片段长1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸。该毒株裂解位点的氨基酸序列为RRRKKR，具有高致病性的分子特征；该毒株有6个潜在糖基化位点；受体结合位点的氨基酸分别为YWIHELY，其左侧壁氨基酸为SGVSSA，右侧壁为NGQSGR。该毒株与国内外一些参考毒株的HA基因序列比较，核苷酸同源率为76.8％～98．1％，氨基酸同源率为85．7％～97．4％，属于欧亚种系。     

禽流感病毒分离株A／Chicken／Xinjiang／1／96（H14N5）NP基因序列 …

对ＲＴ－ＰＣＲ扩增的禽流感病毒Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｘｉｎｊｉａｎｇ／１／９６（Ｈ１４Ｎ５）分离株核蛋白基因进行了序列分析。结果表明：所克隆的基因包含了全部核蛋白阅读框架,编码区为１４９４个核革酸,比较性研究表明,该毒株与Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋｎａｈ（Ｇｕｒｊｅｖ）／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５）有很高的同源性,而与人流感病毒株有较大,显示出明显的禽流感病毒特征。     

禽流感病毒A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株NP及M1基因的克隆及序列分析

参照已发表的A型禽流感核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)基因序列及其基因组特性,设计合成了一条通用反转录引物和两对特异性引物,采用RT-PCR法,成功克隆了禽流感病毒国内分离株A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株的NP、M1基因.序列测定结果为NP基因cDNA全长1497bp,编码498个氨基酸.M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸.将其序列与数株A型流感病毒(H9N2)NP及M1基因序列进行比较,NP基因同源性为90.51%～98.46%,氨基酸序列同源性为95.38%～98.59%.M1基因同源性为90.78%～97.36%,氨基酸序列同源性为95.63%～99.60%.     

A型禽流感病毒核蛋白研究进展

A型禽流感是禽类的重要疾病之一。近年来,随着分子生物学的研究深入,对A型禽流感病毒核蛋白的研究也取得了显著的进展,本文概要综述了A型禽流感病毒核蛋白在诊断A型禽流感方面的研究进展。     

H14亚型禽流感病毒核蛋白基因的扩增与克隆

本研究直接从浓缩的鸡胚尿囊液中提取Ｈ１４禽流感病毒的ＲＮＡ,并根据已发表的Ａ型流感病毒株的核苷酸序列,设计一对引物,采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术成功地扩增了ＡＩＶ的核蛋白（ＮＰ）基因,以ｐＵＣ１１９为载体,以大肠杆菌ＪＭ８３为受体菌,并通过限制性分析证实,成功地克隆了该ＮＰ基因     

H5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在Hela细胞的瞬时表达

采用PCR技术从重组质粒pMel-NP扩增得到了禽流感病毒（AIV）A／GOOse／Guangdong／1／96（HSN1）株的核蛋白（NP）基因，将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX—NP阳性克隆转染Hela细胞，48h后经间接免疫荧光试验和Western—blotting检测，NP基因在Hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57ku，它与H5N1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。     

禽流感病毒NP基因的真核表达及抗体检测芯片的建立

为建立一种检测A型禽流感病毒(AIV)抗体的蛋白芯片,本研究以AIV总RNA为模板,RT-PCR方法扩增NP基因,与真核表达载体pFastBacHTa连接,并在昆虫细胞中表达.重组蛋白经纯化及western blot鉴定,点样于醛基包被的载玻片上,制备检测AIV抗体的蛋白芯片.确定芯片反应最佳条件为:点样浓度2 mg/mL,固定24 h,1%BSA进行封闭,一抗稀释度1:100,二抗稀释度1:2000.利用蛋白芯片分别对15个亚型流感病毒免疫血清、SPF鸡血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和现地血清样品进行检测,通过与血凝抑制试验比较,表明建立的蛋白芯片方法具有良好的灵敏性和特异性,为AIV抗体检测及制备检测AIV不同亚型或多种病原抗体的蛋白芯片提供方法.     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对3株H5N1亚型高致病性禽流感病毒新疆株的NA基因进行了扩增,分别得到了3个毒株的NA基因,序列分析表明,3个毒株NA的全长核苷酸序列均为1 380 bp.同源性分析表明,3个分离株之间的核苷酸同源性在95.1%～97.9%之间;与来自青海、浙江、广东、东南亚等不同地区水禽禽流感病毒毒株的同源性为90.3%～98.8%;与分离自香港、浙江、越南等地区的流感病毒同源性为86.7%～97.9%.     

H10亚型和N8亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中H10亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N8亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因序列,分别设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,建立了H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法。该法对含有H10和N8亚型AIV的模板可特异性扩增出267 bp(H10亚型AIV)、464 bp(N8亚型AIV)和693 bp(AIV)目的条带,对H10亚型AIV扩增出267、693 bp目的条带,对N8亚型AIV扩增出464、693 bp目的条带,对其他亚型AIV仅扩增出693 bp目的条带,对常见禽病病原体均未扩增出任何条带。该法对H10亚型和N8亚型AIV检测下限为10~3拷贝/μL。120份临床样品检测结果与病毒分离鉴定一致。研究建立的H10亚型和N8亚型AIV三重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高,为同时快速鉴别检测H10亚型和N8亚型AIV提供一种简便、快速和有效的方法。     

马流感病毒(A/equine/Qinghai/1/94)核蛋白基因的序列测定及同源性分析

根据已发表的马流感病毒核蛋白基因序列，设计并合成一对特异性引物，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）成功扩增出了我国马流感病毒（A/equine/Qinghai/1/94核蛋白基因。将该片段连接到PGEM-T-EASY载体并转化DH5α，提取阳性菌落的质粒径EcRo1酶切的PCR鉴定其大小为1.5kb左右，对其测序并进行分析发现，与A/Equine/Kentucky/2/86,A/Equine/Miami/1/63等关系较近，同源率为93.3%--93.4%，而与我国马流感吉林A/Equine/Jilin/1/89株关系较远，同源率仅为84.6%。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株S1基因的RT-PCR扩增与克隆

利用 ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经 ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增鸡传染性支气管炎病毒 ＳＹ毒株 Ｓ１基因,得到预期的１．７ｋｂ片段。并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒载体ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ酶切位点,在大肠杆菌ＤＨ_(5a)中实现目的基因的克隆,获得ＳＹ毒株Ｓ１基因重组质粒。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组新城疫病毒的拯救

对现地分离的4株H9亚型禽流感病毒HA基因进行序列测定,选取其中1株在新城疫病毒 La Sota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上,构建了表达H9亚型禽流感病毒野生型HA基因的重组新城疫病毒基因组cDNA克隆,经间接免疫荧光和RT-PCR鉴定,结果表明:拯救重组病毒为rL-H9HA;重组病毒MDT≥168 h,ICPI和IVPI均为0,与亲本疫苗株La Sota具有相似的生长特性;重组病毒保持了La Sota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性,具有作为同时预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景.