鸡传染性腔上囊病超强毒致弱株疫苗的研制

以国内分离的鸡传染性腔上囊超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）Ｇ株的致弱株Ｇｔ为种毒研制疫苗,实验室免疫效力试验和安全性试验表明,该疫苗对雏鸡的最适免疫剂量为５０万ＰＦＵ／只,免疫后７ｄ开始产生抗体,１４ｄ时抗体阳转率为１００％,对强毒攻击的保护率为１００％：以５００万ＰＦＵ／只的剂量免疫雏鸡,不引起腔上囊病的临床症状和病理变化,对雏鸡安全可靠;现地应用证明,对肉用鸡免疫一次或保护至其出栏。     

传染性法氏囊病病毒超强毒GZ株VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）52/70株基因组序列，设计并合成了1对特异扩增IBDV VP2基因的引物。以IBDV超强毒（vvIBDV)GZ株基因组为模板，利用PT-PCR技术扩增出了1.5kb的cDNA产物，将VP2基因克隆于pUC119质粒上，得到重组pUC119质粒。对VP2基因全序列进行了测定。序列分析和聚类分析表明，GZ株与欧洲超强毒株UK661非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列，设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物。以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板，用RT-PCR扩增出了1．45kb的cDNA产物，将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上，获得了pMD18-T-VP2重组质粒。将IBDV HN01株VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较，绘出系统进化树。结果表明，HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。     

传染性法氏囊病病毒超强毒株F9811VP2基因的克隆及序列分析

根据NCBIG GeneBank记载的传染性法氏囊病病毒超强毒（vvIBDV）OKYM株的核苷酸序列，设计并合成1对特异性扩增IBDV主要宿主保护性抗原VP2基因的引物。从IBDV F9811感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA，经RT－PCR扩增出约1．5kb的基因片段，采用平端连接法将此基因片段克隆至pUC119质粒的Sma I位点上。经核苷酸序列测定，并与国内外其他vvIBDV VP2基因序列进行比较分析，发现F9811与OKYM在VP2基因上有18个核苷酸不同，但在氨基酸序列上仅212位存在差异，从而从分子生物学角度证明F9811为vvIBDV。对143－382氨基酸区域所作系统进化树分析表明，F9811、G9201与OKYM、UK661、HK46相近，而F9502、G9303与OKYM、UK661、HK46较远，说明我国存在许多不同的vvIBDV毒株。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP3基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDV Gx株进行培育，通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱，对其结构蛋白VP3基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析，从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律。对不同代次细胞毒序列分析的结果表明，细胞毒在第8代以前，VP3基因序列没有改变，与标准超强毒HK46株氨基酸同源性达99％以上；细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变；10代毒VP3基因与标准弱毒P2株氨基酸序列同源性达100％；细胞适应毒传至20代，其VP3基因序列不再改变。从而说明，vvIBDV Gx株在致弱过程中，VP3基因也随之改变。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株VP5基因在病毒致弱过程中的变异研究

利用SPF鸡胚对鸡传染性法氏囊病超强毒(vvIBDV)Gx株进行培育,通过鸡胚成纤维细胞对病毒进行传代致弱,对其非结构蛋白VP5基因核苷酸及推导的氨基酸序列进行分析,从而揭示vvIBDV Gx从超强毒力向弱毒力转化过程中基因的序列变化规律.对不同代次细胞毒序列分析的结果表明,细胞毒在第8代以前,VP5基因序列没有改变,与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达98%以上;细胞毒第9代核苷酸和氨基酸序列发生了改变;10代毒VP5基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达99%;细胞适应毒传至20代,其VP5基因序列不再改变.从而说明,vvIBDV Gx株VP5基因在致弱过程中存在变化规律.     

传染性腔上囊病病毒的分子流行病学研究

综述了传染性腔上囊病（ＩＢＤ）流行的地域差异，传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）的抗原国源性和分子进化及ＩＢＤＶ的分子生态学概况。     

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的５２／７０株ＩＢＤＶ基因组序列,设计并合成了一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以陕西地区分离的ＩＢＤＶ野毒ＸＮ株,ＨＺ株为材料,以其基因组为模板利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ＰＵＣ１１９质粒上,得到重组ＰＵＣ１１９质粒。     

鸡传染性法氏囊病超强毒致弱株的生物学特性研究

将vvIBDV国内分离株-G株经SPF鸡胚和鸡胚成纤维细胞连续传代致弱,得到适应细胞的致弱株。暂命名为IBDVGt。其毒价为2.0×108PFU／ml以上,具有较好的抗原性,对鸡无致病性。返祖试验及病理组织学试验证明,致弱株可在鸡体内连续传至4代,未有返强现象。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒(IBDV)YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析，并和相关毒株进行了比较。结果表明，YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有92．5％和91．8％，与超强毒株UK661的核苷酸和氨基酸同源性均为97．6％，而与当地鸡群中分离的超强毒株HN942的核苷酸和氨基酸同源性则高达98．1％和98．4%，该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

传染性法氏囊病超强毒Gx株的致弱研究

本研究成功将鸡传染性法氏囊病超强毒vvIBDVGx株通过SPF鸡胚的快速培育及鸡胚成纤维细胞传代致弱，揭示了vvIBDV从超强毒力向弱毒力转化过程中，其主要结构蛋白VP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列的变化规律。对不同代次细胞毒进行了序列分析。发现细胞毒在第7代以前，VP2基因序列没有改变。与欧洲标准超强毒氨基酸同源性达100%；细胞毒第8代，有个别核苷酸发生了改变。但没有影响氨基酸序列；细胞毒第9代是变化复杂的过渡代；10代毒VP2基因与欧洲标准弱毒Cu-1氨基酸序列同源性达97%；以后的细胞适应毒至20代。其VP2基因序列不再改变。致病性实验表明原代毒对4周龄SPF鸡致死率为64%。细胞毒第5代的致死率为60%，而20代毒对鸡无致病性。在鸡体内连续传代6代不返强。     

传染性法氏囊病病毒变异株弱毒的培育

传染性法氏囊病病毒３个变异野毒株ＪＤ１、ＪＤ２、ＨＢ）和２个经验血清型１毒株、ＳＣ）直接在鸡胚成纤维细胞上传代,均能不同程度地产生细胞病毒效应（ＣＰＥ）。将５个毒株２１代细胞毒连续回归鸡体５代,除ＪＤ１外,其余毒株均能不同程度导致法氏囊病谱。ＨＺ１４１、ＪＤ１３６、ＳＣ３８、ＪＤ２３７、ＮＢ３８代细胞毒在鸡体内回归５代,均未见法氏囊的眼观病变和组织学变化,囊指数保持稳定,说明ＨＺ１、ＳＣ、ＪＤ１、     

传染性法氏囊病超强毒致弱株的一些特性

某些传染性法氏囊病强毒株（ＨＶ－ＩＢＤＶ）通过鸡胚连续传代适应于鸡胚，鸡胚适应的ＨＶ－ＩＢＤＶ成功地在鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞上生长，表现致细胞病变作用，鸡胚－细胞适应株对实验感染雏鸡的致病性大大降低，无一只死亡，法氏囊病变与标准株的相似，交叉病毒中和试验表明，细胞培养适应与标准株的抗原性有差异，免疫学试验表明，适应株免疫鸡后，对ＨＶ－ＩＢＤＶ强毒感染有很好保护作用，特别是免疫接种后３天攻强毒，适     

传染性法氏囊病病毒变异株弱毒的免疫原性

传染性法氏囊病病毒（IBDV）JD1、JD2、NB变异株和HZ1、SC经典株弱毒分别以300TDID50、5000TCID50、1000TCID50、5000TCID50剂量免疫SPF鸡后的攻毒试验结果表明：IBDV－NB、JD1、HZ1弱毒株可诱导SPF鸡产生很高的血清和抗体,具有优良的免疫原性,弹毒攻击保护率达100％。IBDV－NB毒株的最佳免疫剂量为3000TCID50、IBDV－JD1和HZ1毒析的最佳免疫剂量为5000TCID50。抗体消长规律表明NB毒株－次免疫的有效保护期可达274天,JD1和HZ毒株为214天。     

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列（HamRz）和丁肝病毒核酶序列（HdvRz）。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△VP5HRT,将该感染性克隆与pCAG—GHLJ0504BHRT共转染DF—Ⅰ细胞。IFA,RT—PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDVVP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。     

鸡传染性腔上囊病病毒VP2基因在昆虫细胞中的表达

为了深入研究鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）VP2基因的结构和功能,利用Bac-to-Bac系统研制出含有VP2基因的重组杆状病毒rBac-VP2,将rBac-VP2感染Sf9细胞,并用抗IBDV VP2特异性单克隆抗体经间接免疫荧光试验检测,证实感染重组病毒Sf9细胞能高效表达IBDV VP2基因产物;Western-blotting分析结果表明,VP2基因表达产物的分子质量约为40 ku.     

高致病力传染性法氏囊病野毒致弱株回传SPF鸡致病性的研究

vvIBDV致弱株经4周龄SPF鸡传代培养过程中,对接种鸡的法氏囊、胸腺、脾脏、盲肠扁桃体等免疫器官进行病理组织学检查,并分析主要免疫器官指数.发现随传代次数的增加,法氏囊和胸腺萎缩及脾脏肿大的程度逐渐加重;法氏囊、胸腺、脾脏和盲肠扁桃体内淋巴细胞崩解、坏死及脾脏内网状巨噬细胞增生的程度逐渐加深.试验结果表明,在传代过程中vvIBDV致弱株的毒力又逐渐恢复.     

鸡传染性法氏囊病病毒超强株VP2基因重组新城疫病毒胚胎免疫安全性及效力试验

为研制能够同时预防传染性法氏囊病(IBD)和新城疫(ND)的疫苗,本研究选用表达IBD病毒(IBDV)超强毒株(vvIBDV)VP2基因的重组ND病毒(NDV)LaSota疫苗株(rL-VP2),测定其半数鸡胚感染量、平均鸡胚致死时间、脑内接种指数和静脉内致病指数等指标,按不同剂量接种18胚龄SPF鸡胚,分别于出雏后第9d、第14d和第21d采血,用微量凝集法和ELISA方法测定血清中抗NDV抗体和抗IBDV抗体水平,并于出雏后28d用NDV强毒(F48E9株)和vvIBDVGx株攻毒,评估重组疫苗的胚胎免疫效果。结果显示:按104EID50/枚剂量进行免疫不会影响SPF鸡胚出雏率和出雏后21d存活率,并且该免疫组雏鸡能够对NDV强毒和vvIBDV攻毒提供安全的免疫保护。