大肠杆菌单拷贝rRNA操纵元菌株的构建及其生长特性研究

以1株染色体上的5个rRNA操纵元（rrnA、rrnD、rrnE、rrnG和rrnH）被敲除的大肠杆菌（Escherichia coli）菌株SQ88为出发菌,运用入Red同源重组系统和卡那霉素抗性基因筛选重组子,并利用抗性基因两端的FRT位点通过位点专一性重组将抗性基因去除,最终成功构建了1株仅具有单拷贝rRNA操纵元（rrnB）的E．coli菌株——SQ88C。试验结果发现,此菌株并未出现明显的生长障碍,其生长速率和rRNA／蛋白值与出发菌株SQS8相比有所下降,但并不显著。从而证明了单拷贝rRNA操纵元在一定条件下能够满足大肠杆菌正常生长的需要,也为在大肠杆菌及其他菌株中快速精确地构建多rRNA基因缺失菌株提供了有益的参考,并可望在16SrRNA基因突变研究等方面发挥一定的作用。     

1型和2型鸭疫里默氏菌的交叉保护

通过PCR扩增、克隆、序列测定获得29株鸭疫里默氏菌(RA)的16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区的核苷酸序列.将16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列连接后分析发现,1型菌株和大多数2型菌株分别处于不同的分支,而2型菌株中的RAf11、RAf3和RAf104不处在2型菌株的分支中,却与1型菌株非常接近.挑选RAf11菌株和2型分支中的RAf19菌株,分别制备灭活苗,免疫雏鸭后进行攻菌保护试验,RAf11菌株对1型菌株的攻击可产生较高的交叉保护率,达53.8%,而RAf19菌株对1型菌株攻击的保护率仅为23.1%.借助16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列的分析,筛选到一株具交叉保护的RA菌株.     

产胞外淀粉酶极端嗜盐古菌CY的16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育分析

从云南省一平浪盐矿采集盐矿样品,采用丰富的嗜盐培养基富集,平板划线分离,淀粉平板检测,分离到1株产胞外淀粉酶的极端嗜盐古菌,暂时命名为CY。采用通用的引物,对其16S rRNA基因进行PCR扩增、克隆和测序,并对16S rRNA基因序列进行系统进化分析,从16S rRNA基因序列的同源性比对发现CY菌株属于嗜盐古菌Halorobrum属。     

太湖流域河川沙塘鳢线粒体12S和16S rRNA基因序列分析

作为东南亚所特有的小型经济鱼类之一的太湖流域河川沙塘(Odontobutis potamophila)长期被归为河川沙塘鳢.为明确太湖流域河川沙塘鳢在沙塘鳢属中的分类地位,克隆测定了其线粒体12S和16S rRNA基因部分序列.在同源的658 bp长的12S rRNA基因序列中,有变异位点187个,简约信息位点133个;在同源的528 bp 的16SrRNA基因同源序列中,有变异位点98个,简约信息位点45个.通过与其他沙塘鳢属鱼类的12S rRNA基因 列比较发现,太湖流域河川沙塘鳢与福建河川沙塘鳢的种内遗传距离为0.114,大于种内的遗传距离(0.00 ～0.024),且在16S rRNA基因序列分析中发现,太湖流域河川沙塘鳢与中国河川沙塘鳢的种内遗传距离为0.123,大于种内的遗传距离(0.00～0.016).12S和16S rRNA系统发育分析也表明,太湖流域河川沙塘鳢有别于其他类别的沙塘鳢,且与已知的河川沙塘鳢存在分子遗传进化差异.     

基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究

利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNAPCR扩增,并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较,克隆到的序列与Y15856的同源性最低,为99.6%;与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高,达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。     

基于16S rRNA基因序列分析的临床分离乳源菌鉴定和系统进化研究

利用16S rRNA基因序列分析方法对1株临床分离乳源菌进行鉴定并确定菌株的进化位置。抽提细菌DNA基因进行16S rRNAPCR扩增,并对扩增产物测序。成功扩增出长度为1 432 bp的核苷酸序列。该临床分离的乳源菌与GenBank上的已知序列进行了同源性比较,克隆到的序列与Y15856的同源性最低,为99.6%;与AB305019、D83353.1和FM875711.1的同源性最高,达99.9%。该试验菌为金黄色葡萄球菌且16S rRNA基因是高度保守的。利用16S rRNA基因序列分析鉴定细菌是一种快速、准确、方便的方法。     

高效溶栓菌株的筛选鉴定及活性测定

以日本纳豆、重庆江津豆豉、忠县豆腐乳为原料,采用酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛,得到18株产溶栓酶的菌株.通过纤维蛋白平板实验,从忠县豆腐乳中筛选出1株具有较高溶栓活性的菌株FR-033(登录号:HQ009804),菌株经液体发酵后获得含酶发酵液,采用硫酸铵分段盐析及sephadexG-50凝胶层析进行纯化,获得较高纯度的溶栓酶,酶活力为2 163 IU/mL.进一步对FR-033菌株的形态和生理生化特征进行研究.利用细菌16S rDNA通用引物对16S rRNA进行PCR扩增并测序,得到1444 bp长度的DNA序列,通过BLAST软件在NCBI网站收索其同源性性序列,利用PAUP4.0和MAGE4软件绘制系统发育树,结果表明:菌株FR-033与枯草芽孢杆菌(Bacil-lus subtilis)的16S rRNA序列同源性达99%以上,在系统发育树中,菌株FR-033与枯草芽孢杆菌在同一支上,且遗传距离最短;FR-033的形态及大部分生理生化特征与枯草芽孢杆菌极为相似,表明该菌株是枯草芽孢杆菌(Ba-cillus subtilis)的一个高效的产溶栓酶菌株.     

产3-羟基丁酮菌株的分离·筛选与鉴定

从土壤中分离获得一株高产3-羟基丁酮的菌株ME-N11。该菌株3-羟基丁酮转化率高,仅产生少量的2,3-丁二醇、乙醇、乙酸等副产物,具有重要开发应用价值。在对其形态特征及生理生化特性分析的基础上,采用PCR扩增了其16S rRNA基因,并进行了测序。基于该菌的生理生化特性与16S rRNA基因的同源性进行比较及系统发育分析,发现该菌株和Bacillus subtilis同源性达99%,命名为Bacillus subtilis ME-N11。     

海南不同地理群体羊鲍18SrDNA的克隆与序列分析

[目的]对海南不同地理群体羊鲍18S rDNA进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]采用分子生物学的方法,对海南不同海区的2个羊鲍地理群体18S rRNA基因全长进行克隆和序列分析,并将得到的羊鲍18S rRNA基因序列与同海域耳鲍的进行比较。[结果]同一地理群体内羊鲍核糖体18S rRNA基因序列完全一致;不同地理群体间羊鲍核糖体18S rRNA基因在碱基组成上的相似率为99.5%,仅在某些位点处发生了碱基替换,即腺嘌呤(T)被鸟嘌呤(G)替换;同时,将这两个不同群体中羊鲍的18S rRNA基因与同一海域耳鲍18S rRNA基因序列进行比较分析发现,它们之间也只是发生了碱基替换。[结论]为海南鲍鱼特别是羊鲍的遗传多样性、遗传结构、种质鉴定及其种质资源的保护和利用等方面的研究提供可靠依据。     

16S rRNA鉴定乳酸片球菌分离株

根据乳酸片球菌的16S rRNA基因序列,设计2条特异性引物,以PCR方法扩增从酸白菜中分离得到的具有抑制单核细胞增多症李氏杆菌作用的乳酸片球菌菌株的16S rRNA基因序列,经克隆和测序后,与以往发表的基因序列进行比较,同源性99%,从基因水平上进一步证明该菌株为乳酸片球菌。     

一株产紫红色色素的沙雷氏菌的分离与鉴定

[目的]为有效预防和控制由沙雷氏菌引起的多种疾病提供依据。[方法]以华蓥山香菇作为研究材料,从其表面中分离出了1株产紫红色色素的细菌,采用形态学、生理生化方法对其进行初步鉴定;提取基因组DNA,采用16S rRNA的通用引物,PCR扩增16S rDNA基因片段,克隆入pMD-18T载体,转化E.coliDH5α,筛选阳性重组质粒鉴定后测序;通过多序列比对和同源性分析,构建系统发育树。[结果]该菌株革兰氏染色阴性,与沙雷氏菌属菌的同源性最高,命名为Serratiasp.JG05。扩增得到序列大小为1 506 bp,系统发育树表明JG05与Serratiasp.BBTR23的亲缘关系最近,核苷酸水平有99.20%的相似性。[结论]该研究为进一步研究这种附生菌与香菇的共生关系,以及它们之间的作用机制奠定了基础。     

嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因克隆及系统发育

[目的]确定嗜热蛋白酶生产菌DPE7的系统发育地位。[方法]通过PCR方法扩增出嗜热蛋白酶生产菌DPE7的16 S rRNA基因片段,并对其进行了克隆和测序。[结果]对该序列在GenBank中的BLAST结果表明,相似性高于99%的序列中大部分是泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列,其中与Geobacillus toebii T1680的16 S rRNA基因序列相似性达99.60%。对菌株DPE7和其他13株泥土芽胞杆菌的16 S rRNA基因序列进行系统发育分析,菌株DPE7与其中的4株泥土芽胞杆菌聚类在一起。[结论]经16 S rRNA基因序列同源性比较和系统发育分析,确定菌株DPE7为泥土芽胞杆菌。     

一株放线菌的分子鉴定与抗菌谱研究

[目的]对具有抗菌开发前景的放线菌Q13菌株进行分子鉴定和抗菌谱测定,为其进一步开发和利用提供理论依据。[方法]以Q13基因组为模板,分别利用大肠杆菌和链霉菌属16S rRNA基因特异引物,扩增其16S rRNA基因序列并测序,利用Blast、MEGA等软件进行序列与系统发育树分析,鉴定其分类地位;进一步利用平板对峙试验,测定Q13菌株对玉米小斑病菌等14种植物病原真菌、胡桃肉状菌等2种食用菌病原真菌和双孢蘑菇等10种食用菌的抑菌活性。[结果]获得3条16S rRNA基因序列,GenBank登录号分别为JN593095、JN593096和JN5930957;根据序列分析的结果,确定Q13菌株为Streptomyces flavotricini;Q13菌株对小麦赤霉病菌、稻瘟菌、油菜菌核和绿色木霉具有显著抗性,而对双孢蘑菇、蛹虫草、灰树花、香菇、姬菇和平菇等食用菌菌丝生长无抑制作用。[结论]为开发植物和食用菌病害生防菌提供了理论和试验支持。     

芝麻粕降解菌株的筛选诱变及鉴定

从自然界筛选得到一株能够降解芝麻粕粗蛋白的菌株LQ,对其16S rRNA基因序列进行了测定,构建了分子系统发生树,分析了相关细菌相应序列的同源性。结果表明:菌株LQ的16S rRNA基因序列长度为1 447 bp,与芽孢菌属等细菌的16SrRNA基因序列自然聚类,在检索出的芽孢杆菌序列中,该菌株与解淀粉芽孢杆菌的同源性达99%,为解淀粉芽孢杆菌。对菌株LQ进行紫外诱变,其蛋白酶活力587.3 U/mL。     

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

 【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育,为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中,68株供试菌分为11个遗传群;在16S rRNA PCR-RFLP分析中,68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16S rDNA 全序列分析表明,供试菌分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动细菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、短状杆菌属（Brachybacterium）和泛菌属（Pantoea）。其中,假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。     

萘降解菌NAP2-2的16S rRNA基因克隆和系统发育分析

筛选到1株萘降解菌NAP2-2,对其进行了表观及16S rRNA基因的系统发育研究。结果表明,NAP2-2能以萘作为唯一碳源和能源生长。16S rRNA基因同源性分析显示,该菌株为短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的一个成员。对萘降解菌16S rRNA基因序列的系统发育学分析表明,降解菌主要分布在变形菌门和厚壁菌门。因此对NAP2-2菌株的分析揭示了短芽孢杆菌属新的生物学特性,为以后利用此类细菌处理多环芳烃污染提供了重要依据。     

春秋两季不同地区猪源耐药大肠杆菌β-内酰胺酶及16SrRNA甲基化酶基因检测及分析

为了解新疆春秋两季不同地区耐药猪源大肠杆菌携带β-内酰胺酶和16S rRNA甲基化酶基因及其共存情况。通过PCR方法对克拉玛依地区142株春季猪源耐药菌、9株克拉玛依秋季猪源耐药菌、78株昌吉地区春季猪源耐药菌和52株昌吉地区秋季猪源耐药菌进行β-内酰胺酶(blaTEM、blaCMY-2、blaLAP-1、blaKPC、blaSHV和blaOXA)和16S rRNA甲基化酶(arm A和rmt B)基因检测,并对检出耐药基因的PCR产物进行测序。结果显示:克拉玛依春季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(142/142,100%)、blaOXA(16/142,11.3%)、blaCMY-2(7/142,4.9%)和blaLAP-1(1/142,0.7%);克拉玛依秋季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶为blaTEM(9/9,100%)和blaOXA(1/9,11.1%),克拉玛依春秋两季猪源耐药菌均未检测出16S rRNA甲基化酶基因;昌吉地区春季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(78/78,100%)、blaOXA(9/78,11.5%)、blaCMY-2(3/78,3.8%)和16S rRNA甲基化酶基因rmt B(1/78,1.3%);昌吉地区秋季猪源耐药菌携带的β-内酰胺酶基因为blaTEM(52/52,100%)、blaOXA(4/52,7.7%)、blaCMY-2(3/52,5.8%)和blaSHV(1/52,1.9%),未检测出16S rRNA甲基化酶基因。上述结果表明春秋两季不同地区猪源大肠杆菌blaTEM检出率均为100%;其次不同地区春季猪源大肠杆菌对blaOXA检出率均高于秋季猪源大肠杆菌。产生β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因是猪源菌对β-内酰胺类及氨基糖苷类抗菌药物耐药的主要原因之一,养殖场应合理使用抗菌药物,加强对产生β-内酰胺酶及16S rRNA甲基化酶基因的监控。     

三疣梭子蟹牛奶病病原的分离鉴定

从浙江舟山市养殖场患“牛奶病”的三疣梭子蟹(Portunus tritubercularus)乳化的螯足、步足及肝胰脏中分离到1株细菌A1,对其进行了形态特征、生理生化测定和16S rRNA基因序列比较鉴定,并对其药物敏感性进行了检测。结果表明,分离菌株A1为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),其对丁胺卡那霉素、氟苯尼考、盐酸蒽诺沙星、甲磺酸培氟沙星、盐酸左氧氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、环丙沙星、诺氟沙星、新霉素、氧氟沙星等高度敏感,对青霉素钠、头孢曲松、酒石酸吉他霉素、头孢氨苄、四环素、麦迪霉素、土霉素等中度敏感,而对磺胺喹噁啉钠、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶钠、磺胺嘧啶等不敏感。     

拮抗杉木致害菌Fusarium oxysporum海洋细菌3728的生物学特征及其鉴定

从南海红树林木榄(Bruguiera gymnorrhizo)根际土壤中分离到一株具有拮抗杉木致害菌尖孢镰刀菌萎蔫专化型SF2(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum)活性的海洋细菌3728菌株,对分离菌株的形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列进行了系统的研究。发现细菌3728与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)序列相似性最高,达到100%,在系统进化树中与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis AJ276351)处于同一分支上,结合形态和生理生化分析结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌。