梅山猪、大白猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的14个表达序列标签的分离、鉴定及组织表达分析

为了揭示猪杂种优势的分子机理,利用mRNA差异显示技术研究梅山猪,大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异,分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST),并用半定量RT-PCR鉴定.核苷酸序列分析表明,这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14条EST被提交到GenBank数据库.组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达,说明这些基因对生命过程很重要.这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异,猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果.     

番茄乙烯信号转导相关基因EIN3（Le-EIL）的克隆和表达

摘要：根据拟南芥?穴Arabidopsis thaliana ?雪、烟草?穴Nicotiana tabacum ?雪EIN3基因保守区序列设计简并引物，采用RT-PCR扩增从番茄(Lycopersicon esculentum )果实中得到一个486 bp的同源片段。以此片段作为探针，从番茄果实cDNA文库中分离到一个拟南芥EIN3的同源基因的cDNA克隆,命名为Le-EIL。该克隆含有一个1 845 bp的开放阅读框，编码615个氨基酸。经同源分析，它与烟草TEIL基因的同源性为79%，与拟南芥EIN3、EIL1、EIL2和EIL3的同源性分别为59%、56%、52%、46%。Le-EIL基因表达与番茄果实的成熟及乙烯生成情况具有较强的相关性。在普通番茄果实的不同成熟时期Le-EIL基因都有表达，并且随着成熟度的增加基因表达有明显的增强，在转色期和粉红期Le-EIL基因的表达最强, 在全红期后减弱。在转反义ACS基因的转基因番茄果实中，只有开花后60 d的果实中Le-EIL基因有微弱的表达，在其它成熟时期均没有表达。     

重复序列设计原核细胞差异显示RT-PCR引物研究进展

由于原核细胞mRNA3'端不存在ploy(A)结构,因而原核细胞DDRT-PCR引物设计不同于真核细胞。尽管不能根据oligo(dT)设计引物,但利用全基因中高度分散重复的短序列或回文序列却能有效地克服mRNA分子结构影响,最大限度地扩增全长cDNA。并且这两种引物设计方法还可以提高RNA指纹图谱的重复性,降低反应的假阳性,为原核细胞DDRT-PCR引物设计提供新的思路。     

鸡胃肠道生长抑素(SS)mRNA表达的组织特异性

以30dArborAcre(AA)肉鸡为模型,采集胃肠道样品,采用相对定量RT-PCR方法研究了生长抑素(SS)mRNA在鸡胃肠道分布的组织特异性。结果表明,腺胃SSmRNA的表达量高于所有肠段,差异极显著(P<0.01);十二指肠和空肠SSmRNA的表达丰度相似,二者均显著高于回肠(P<0.05)。定性研究显示,肌胃和结直肠均有SSmRNA表达,但其表达量显著低于腺胃、十二指肠、空肠和回肠。SSmRNA在主要的消化(腺胃)、吸收(十二指肠和空肠前段)器官的高丰度表达,提示SS对营养物质的消化吸收具有重要的调控作用。异性     

杂种和纯种猪之间脂肪组织差异表达基因的分离、克隆和序列分析

实验选取中国地方品种梅山猪和外国品种大白猪进行正反向杂交产生杂种梅大和大梅猪,用mRNA差异显示技术,分析了亲本和杂种猪背部皮下脂肪组织间基因差异表达。结果发现,在10条5＇端随机引物和10条3＇端锚定引物共100对引物组合的差异显示扩增下,共获得l500多条可重复的扩增条带,选取其中能够重复出现的40条差异表达带（在4组样本中不能同时出现的条带）进行重扩增、克隆并测序。通过GenBank／BLAST比对发现,其中有4条EST分别与GenBank序列同源性较高,其余36条属于新的EST,将这36条EST提交GenBank获得注册号,并选取其中的3条进行半定量RT-PCR验证并检测其相对表达,其中2条表现不同程度的差异,l条没有明显差异。为提高DDRT-PCR真阳性,实验中的4种组合各屠宰6头以建立RNA池,采取低高严谨结合的退火温度进行差异显示扩增以及只回收在2次PCR扩增均能重复出现的条带。结果表明,所获得的36条新的EST在亲子代之间的差异表达方式不尽相同,这些差异表达的基因可能与脂肪组织杂种优势的形成有关。     

缺磷对不同作物根系形态及体内养分含量浓度的影响

采用营养液培养方法,以水稻、 小麦、 玉米和大豆为试验材料,研究了短期缺磷（2周）诱导根表沉积铁氧化物是否为水稻特有的性质,以及缺磷对不同作物根系形态及其吸收钾、 钙、 铁、 锰、 铜、 锌营养元素的影响。结果表明,供磷和缺磷处理并没有影响小麦、 玉米和大豆3种作物根系的颜色,而缺磷处理水稻根表沉积了铁氧化物而呈红（黄）棕色,且铁氧化物不均匀地富集在根细胞壁的孔隙中; 缺磷促进了水稻,小麦,玉米和大豆根系的生长,分别比供磷处理伸长了11%、 11%、 20%和11%（P0.05）。此外,缺磷胁迫下水稻根表铁氧化物增强了钙、 铁、 锰、 铜和锌在根表的富集而成为其进入根系的缓冲层。缺磷处理水稻根中铁浓度明显高于供磷处理（P0.05）,而地上部铁的浓度仅为磷营养正常水稻植株的18%,这说明缺磷诱导的铁氧化物促进了根系对铁的吸收但抑制了铁由根系向地上部的转运。短期缺磷对其他养分在水稻根中和地上部的浓度没有明显影响。对于其他 3 种作物,短期缺磷没有明显影响钾、 钙、 铁、 锰、 铜和锌在其根表富集及在植物体内的浓度。因此,在供试的4 种作物中,由于磷胁迫诱导根表形成铁氧化物是水稻特有的性质,铁氧化物的沉积可促进铁的吸收但抑制了铁向地上部的转运,而短期缺磷并没有影响其他3种作物对钾、 钙、 铁、 锰、 铜和锌养分的吸收和转运。     

Chloroplast DNA study in sweet cherry cultivars (Prunus avium L.) using PCR-RFLP method

The chloroplast DNA of 96 sweet cherry cultivars (Prunus avium L.) and five cultivars of sour cherry (P. cerasus L.) were analysed to reveal their haplotypes using PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) method. The main advantages of the PCR-RFLP technique are: resolutive, time and cost effective and reproducible. Approximately 9.6% of the chloroplast genome was analysed, using six universal primer pairs and two restriction enzymes. All the mutations detected were insertion-deletions, ranging between 5–30 bp. The combination of all the mutations resulted in three haplotypes (H1, H2 and H3) in the 96 sweet cherry cultivars and a single haplotype (H4) in the five cultivars of sour cherry. The cpDNA polymorphism determined by PCR-RFLP markers helped to understand the maternal inheritance of chloroplast genome in sweet cherry, clearly distinguished the sour from the sweet cherry, and supported that P. avium is not the maternal species of P. cerasus.     

磷饥饿诱导水稻根表铁膜形成机理初探

采用溶液培养的方法,初步探索了磷饥饿诱导水稻根表铁膜形成的机理。磷饥饿24h后水稻的根表出现了明显的红棕色物质的沉积,扫描电镜的能谱分析结果显示,红棕色物质是铁的氧化物。针对这一现象,首先研究了没有水稻生长的正常磷营养液和缺磷营养液的变化,结果表明二者之间全波长的扫描图谱没有出现差异。采用酸碱混合指示剂的琼脂染色方法,观察了水稻根系表面及根际pH值的变化情况,并分别测定了正常磷营养（P）和缺磷（P0）2种条件下水稻的根系活力。结果看出,缺磷时水稻根系活力高于磷营养正常的处理,尤其是基因型Jin23A,其P和P0处理间根系活力差异极显著。水稻根表三价铁的浓度高于二价铁,并且缺磷根系表面三价铁和二价铁浓度均明显高于供磷处理;缺磷处理水稻根质外体沉积的铁浓度也明显高于供磷处理。因此,初步确定磷饥饿诱导水稻根表铁膜形成是生物学基础上的化学反应过程。     

多重实时RT-PCR快速检测新型甲型H1N1流感病毒

从GenBank中获取新型甲型H1N1流感病毒(2009年流行株)HA和NA基因序列,通过多重序列比对之后,设计合成H1和N1基因特异性的引物和探针,用来建立新的甲型H1N1亚型流感病毒的多重实时RT-PCR检测方法.合成的两条荧光探针分别标记FAM和CY5荧光报告基团,荧光淬灭均使用BHQ基团.多重实时RT-PCR实验在ABl7500实时PCR仪上进行,经过40个循环的扩增之后,阳性对照出现标准的S型曲线,并且具有良好的特异性,可以很好地将新的甲型H1N1与传统的甲型H1N1以及H3N2、H5N1、H6N2和H9N2等流感病毒区分.多重实时RT-PCR可以检测到10个拷贝的模板,灵敏度接近检测方法的极限.检测时间短,从加样到反应结束只需要90 min.在对243例发热病人临床样品检测过程中发现7例阳性,1351份猪临床样品检测中未发现阳性,该检测结果和采用中国检验检疫科学研究院研制的试剂盒获得的检测结果一致.本研究所建立的快速、准确和高敏感性的多重实时RT-PCR方法非常适用于新型甲型H1N1流感病毒的实验室筛查.     

一个水稻根时空差异表达启动子的克隆及功能分析

本研究旨在分离克隆水稻根特异表达的启动子,为育种提供资源.本实验结合本室芯片数据库和RT-PCR验证得到一个水稻根特异表达的基因(TIGR Locus:Loc_Os05g19570),采用PCR技术从MH63的基因组DNA中扩增其上游启动子P12,长度为1950 bp,将该启动子片段与报告基因gus相连,构建植物表达载体,农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导转化水稻(Oryzative ssp.japonica)中花11.组织化学分析及荧光定量测定显示该启动子具有根特异性及时间差异性.根据P12启动子序列特征,利用PCR对其进行有目的的缺失,将5个长度不同的缺失片段分别与gus相连,构建植物表达载体,转化水稻中花11.荧光定量测定结果表明:-1059～-819bp区域缺失后,报告基因在根里的表达量显著降低,说明这个区域可能存在顺式元件.本研究成功的分离克隆到一个水稻根特异的启动子P12,进一步分析发现其还具有时间差异性.     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...