乙烯受体基因LeFTR1和LeFTR4的克隆及在番茄果实中的表达

为研究野生型番茄(Lycopersicon esculentum Mill．cv．Lichun)和转反义ACS番茄果实中乙烯受体基因上eETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。     

蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

实验成功地构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15，抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^＋表型分析表明，目标基因已经重组到宿主基因组染色体上；0．5％甲醇诱导表达后，SDS—PAGE结果显示，表达蛋白的相对分子量约为23kD，活性电泳出现明显活性条带；酶活性测定显示，重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右；氯仿-乙醇（3：5／V：V）和KCN（5mmol／L）抑制反应进一步证明，所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。     

低温贮藏对美味猕猴桃布鲁诺果实主要挥发性物质和脂肪酸代谢的影响

为探讨贮藏温度对美味猕猴桃果实风味品质的影响,将猕猴桃布鲁诺果实贮藏于常温(20±0.5℃)、低温(1±0.5℃)下,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定猕猴桃果实常温和低温贮藏后主要挥发性成分的种类和含量变化;同时,分析果实挥发性成分合成的脂肪酸代谢途径底物(亚麻酸、亚油酸)含量、关键酶活性及其基因表达量的变化。结果表明,与常温相比,低温贮藏降低了猕猴桃果实中酯类物质的种类和相对含量,保持较高醛酮类物质种类和相对含量;常温贮藏下猕猴桃果实风味物质随贮藏时间变化明显,而低温则能够较好维持猕猴桃果实的特征风味。与常温贮藏相比,低温贮藏抑制了脂肪酸代谢中脂氧合酶(LOX)、脂氢过氧化物裂解酶(HPL)、乙醇脱氢酶(ADH)以及醇酰基转移酶(AAT)等关键酶活性及其基因的表达,降低了果实亚油酸和亚麻酸的分解,通过脂肪酸代谢途径合成的酯类物质也因此有所降低。本研究为低温贮藏调控猕猴桃果实风味物质合成及维持猕猴桃果实特征风味提供了理论依据。     

乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的克隆及在番茄果实中的表达

摘要：为研究野生型番茄（Lycopersicon esculentum Mill. cv . Lichun）和转反义ACS 番茄果实中乙烯受体基因LeETR1和LeETR4的表达与乙烯的关系，实验用RT-PCR方法扩增了乙烯受体基因LeETR1和LeETR4片段，用两片段作探针进行Northern 杂交。结果表明：两受体基因的表达在番茄果实成熟进程中变化不明显，LeETR4在同一时期的果实外果皮中表达水平低于其在辐射壁和中柱的表达。转反义ACS番茄果实中LeETR1和LeETR4的表达水平显著低于野生型番茄果实，外源乙烯处理转反义ACS番茄果实，促进两个受体基因的表达。可见果实中LeETR1和LeETR4的表达受乙烯调控的影响。     

采收成熟度对毛花猕猴桃华特果实采后品质和贮藏性的影响

为探讨不同采收成熟度毛花猕猴桃华特果实采后贮藏品质差异,确定华特果实最佳采收期,以成熟度Ⅰ(盛花后155 d)、成熟度Ⅱ(盛花后165 d)和成熟度Ⅲ(盛花后175 d)的毛花猕猴桃华特果实为原料,研究果实采后贮藏过程中硬度、可溶性固形物(SS)含量、可滴定酸(TA)含量、抗坏血酸(AsA)含量、腐烂率和主要挥发性成分的变化规律。结果表明,在常温贮藏20 d期间成熟度Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ果实采后分别检出41、33和36种挥发性成分,均以醛酮类为主。其中,成熟度Ⅰ果实酯类和醛酮类相对含量较高;成熟度Ⅱ果实醛酮类、醚类、烃类相对含量较高,但酯类和醇类相对含量较低;成熟度Ⅲ果实醛酮类、酯类和醇类相对含量较高。因此,成熟度Ⅰ和Ⅱ果实采后的营养及风味品质较好,腐烂率低,贮藏性较好;成熟度Ⅲ果实尽管风味较好,但果实的营养品质较差,腐烂率高,贮藏性较差,因此建议华特果实尽量在盛花后165 d前采收。本研究为确立毛花猕猴桃华特果实最佳采收成熟度提供了理论依据。     

蜡样芽胞杆菌M22Mn-SOD基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好.     

奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达

应用RT—PCR技术从经体外植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛外周血淋巴细胞的总RNA中扩增出牛γ-干扰素(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)基因。将扩增出的BovIFN-γ克隆到PMD18-T载体中,经过限制性酶切分析筛选正向插入的克隆。测序结果表明,所克隆到的基因编码区序列与已报道基因存在3个核苷酸的差异。将该基因片段从PMD18-T载体中用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／zeo ( )中,构建真核表达载体pcDNA—BovIFN-γ,通过脂质体转染COS-1细胞,用鼠抗BovIFN-γ高免血清和FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光实验(IFA)检测,结果表明,在COS—1细胞的细胞膜和胞浆内均有rBovIFN-γ表达,细胞病变抑制实验证实,转染后细胞培养上清液具有一定的干扰素活性,转染后72h细胞培养上清液在MDBK细胞上抑制VSV病毒的效价可达到128IU／mL。研究结果为进一步筛选稳定表达BovIFN-γ基因细胞系、开发奶牛疾病预防控制的新产品以及开展奶牛疾病的基因治疗奠定了基础。     

热激和山梨酸钾处理对猕猴桃果实灰霉病的抑制效应

为了探究热激和山梨酸钾对离体灰霉菌(Botrytis cinerea)及猕猴桃果实采后灰霉病的抑制效应,用48℃热水(Hot Water Treatment,HT)和5 g/L山梨酸钾溶液(Potassium Sorbate,PS)及二者复合(PS+HT)分别处理离体灰霉菌和接种过灰葡萄孢霉的猕猴桃果实。离体试验以不添加山梨酸钾的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)培养不加热处理的灰霉菌悬液为对照,结果表明与对照相比,PS和PS+HT处理均能显著抑制离体灰霉菌菌丝生长(P<0.05)。损伤接种试验以常温即18℃下清水浸泡接种灰霉菌的猕猴桃果实为对照,浸泡后果实分别贮藏在0℃和24℃,结果表明在2种温度贮藏条件下,上述处理均可以显著诱导提高多酚氧化酶、过氧化物酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性(P<0.05),从而抑制果实病斑扩散,显著降低果实发病指数(P<0.05)。其中复合处理抑菌效果最佳,而PS、HT单一处理的果实病斑直径在贮藏后期与对照差异不显著(P>0.05)。此外,为了进一步探究上述处理是否对猕猴桃果实冷藏品质产生影响,将对照及不同处理组果实在0℃下贮藏90 d,每10 d测定品质相关指标。结果表明,与对照相比,PS+HT复合处理延缓了可滴定酸和维生素C含量的下降,并且显著降低了果实失重率和腐烂率(P<0.05),提高了猕猴桃果实耐贮性,对延缓猕猴桃果实衰老和减轻采后腐烂衰败具有重要的意义。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛(Bos tarus)的增食欲素受体1(HCRTR1)基因编码区全长,获得1 278 bp编码区全长序列(GenBank登录号:DQ874350),将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%.阳性质粒经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,将目的片段定向克隆到pET32a( )表达载体上,转化B121(DE3)感受态大肠杆菌(Escherichia coli),经鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE表明,秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中没有表达,进一步生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,复杂的蛋白质结构使得其不能在原核表达系统中获得表达.     

后熟过程中植物生长调节剂对猕猴桃电阻抗图谱特性的影响

为了探索植物生长调节剂对后熟过程中猕猴桃电阻抗图谱的影响,检测了膨大果和未处理的对照果的电阻抗图谱,观察了2类猕猴桃果肉组织细胞微观结构的变化,利用Hayden等效电路模型分析了后熟过程中猕猴桃果肉组织细胞外液电阻、细胞内液电阻和细胞膜阻抗的电学特性变化。后熟过程中,低频时膨大果阻值较大但变化较小,高频时2类猕猴桃阻值趋于一致;频率为12k Hz时相位角最大;2类果的Cole-cole图均为一段圆弧,对照果的圆弧半径变化较大;膨大果细胞膜阻抗差异不显著,对照果从第7天开始细胞膜阻抗急剧减小;对照果细胞外液电阻低于膨大果,从第7天开始2类果均呈现减小趋势。电阻抗图谱法揭示了后熟过程中对照果与膨大果的电阻抗特性变化规律,为猕猴桃膨大果的检测识别提供了研究基础。     

南方红豆杉扦插繁殖技术研究——Ⅷ.扦插苗与实生苗生理代谢比较

对南方红豆杉扦插苗与实生苗根系、叶片若干生理代谢指标比较研究结果表明,南方红豆杉实生苗长势较扦插苗旺盛,根系活力及呼吸强度、叶片内源吲哚乙酸、绿原酸、N、P、K和粗蛋白质及游离氨基酸含量均高于扦插苗;而叶片吲哚乙酸氧化酶和过氧化物酶活性、脱落酸含量则低于扦插苗。     

南方红豆杉扦插繁殖技术研究——Ⅲ.叶面肥与透光度对扦插苗生长的影响

试验研究叶面肥和透光度对南方红豆杉扦插苗生长的影响结果表明,喷施叶面肥对扦插苗生长和叶绿素含量的影响呈正效应,而透光度的影响则呈负效应,且前者效应大于后者。喷施叶面肥和未喷施叶面肥处理间扦插苗新梢长、苗鲜物质量和根鲜物质量及叶绿素含量间差异均达显著水平;且喷施叶面肥处理40%与80%透光度间以上指标差异达显著水平,40%与60%透光度间或60%与80%透光度间差异仅部分指标差异显著;而未喷施叶面肥处理透光度对扦插苗叶绿素含量的影响仅部分处理间有明显差异,但不足以导致扦插苗生长量的显著差异。     

南方红豆杉扦插繁殖技术研究--扦插苗与实生苗光合生理特性比较

对南方红豆杉扦插苗和实生苗光合生理特性比较研究结果表明,南方红豆杉扦插苗叶重、叶绿素a和b、叶绿素总量、CO2补偿点及净光合速率、硝酸还原酶活性均小于相应树龄实生苗。     

南方红豆杉扦插繁殖技术研究——Ⅰ.基质、季节与生物措 施对扦插繁殖的影响

试验研究基质、季节和生物措施对南方红豆杉扦插生根、扦插苗生长和叶绿素含量的影响结果表明,以河沙和珍珠岩按8∶2混配苗床基质最佳,其绿苗率、生根率及成苗率分别为86 .0 %、84 .3%和81.7% ,显著高于其他3种苗床基质;其次为河沙和火烧土混配苗床基质>黄土>单一河沙苗床基质。季节和生物措施效应显示第4季度为扦插最佳时期,扦插效果显著优于其他季节,且扦插后拌种黄豆显著优于未拌种黄豆对照组     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

中国水仙凝集素基因NTA的克隆、序列分析及蛋白结构预测

凝集素是一种糖专一性结合蛋白,它可以识别不同的糖类。植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分。本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698bp,包含一个完整的开放阅读框516bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18615.19Da。序列比对结果表明该基因编码的蛋白与其他单子叶植物如杂种水仙、雪花莲、君子兰、石蒜花和孤挺花的凝集素蛋白的同源性较高,分别为84%、80%、77%、78%以及82%。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。