酶解制备鱼鳞蛋白降血压肽的工艺优化

为有效利用鱼鳞制备降血压肽,以罗非鱼鱼鳞为原料,在121℃条件下进行热预处理15 min后,运用响应面分析法优化酶解制备鱼鳞蛋白ACE抑制肽的工艺条件。结果表明,以水解度和ACE抑制率为评价指标,筛选出碱性蛋白酶为最优酶。在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,最终确立最优的酶解工艺参数为:酶解时间2 h、酶解温度56.3℃、pH值8.0,酶底比1.1%,此条件下ACE抑制率理论值为87.95%,实际值为88.26%。最优条件下制得的酶解产物相对分子质量集中在300～3 000 Da之间,水解效果较好。本研究结果对酶解法制备鱼鳞蛋白降血压活性肽具有一定的实践参考价值。     

酶解牦牛血发酵液制备抗氧化肽工艺优化

为进一步提高牦牛血枯草芽胞杆菌发酵液多肽含量,对牦牛血发酵液进行酶解,以酶解液的·OH清除率、多肽含量为主要指标,筛选酶解发酵液的最适蛋白酶,通过单因素和响应面试验优化酶解工艺,并对比菌酶联合制备产物与发酵液体外抗氧化活性。结果表明,碱性蛋白酶酶解发酵液最佳条件为:酶解时间3 h、p H值9.5、酶解温度60℃和酶底比190 U·g-1,此条件下制备得到酶解液多肽含量为5.52mg·mL~(-1),较发酵液提高2.39倍。菌酶联合制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为6.22、4.87mg·mL~(-1),发酵法制备产物对·O2-及脂质过氧化的IC50分别为8.42、11.71 mg·mL~(-1),且菌酶联合制备产物的还原力优于发酵制备产物。因此,菌酶联合制备牦牛血抗氧化肽法优于传统单一发酵法。本研究结果对提高牦牛血抗氧化肽得率,增加牦牛产品附加值具有重要的意义。     

超声辅助竹节虾头酶解及抗氧化肽分离研究

为了实现竹节虾加工副产物的高值化利用,以竹节虾加工废弃物中的虾头副产物为原料,以水解度和DPPH清除率作为评价指标,采用中性蛋白酶酶解,通过响应面法优化超声辅助酶解工艺,并依次通过超滤、凝胶层析色谱和反相高效液相色谱等分离方法,从竹节虾虾头酶解产物中分离制备抗氧化肽,采用超高压液相色谱串联质谱联用技术对肽的结构进行表征。结果表明,在中性蛋白酶添加量为3 000 U·g~(-1)、p H值7.0条件下,最佳超声辅助酶解工艺参数为超声时间41 min,超声温度55℃,超声频率22 k Hz,料液比1∶9(w/v),在此条件下获得的酶解产物DPPH清除率达69.50%。当水解时间为0.5~2.5 h时,超声辅助酶解的酶解产物水解度和DPPH清除率比非超声辅助酶解工艺分别高17.95%和18.83%,该工艺缩短了酶解时间,节约了能耗。酶解产物经超滤初步分离发现,相对分子质量在3k Da(SHP4)的组分具有显著的抗氧化活性。用凝胶层析法进一步分离纯化SHP4组分后得到4个峰,其中SHP4-II的DPPH清除率最高;SHP4-II通过反相高效液相纯化后也得到4个主要肽峰,在多肽含量为1.5 mg·m L~(-1)时,SHP4-II-4的DPPH清除率最高,达到85.69%,并且具有较好的分离度,质谱分析发现,该抗氧化肽的结构为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro(455.99 Da)。本研究结果为虾肽抗氧化保健食品的研发提供了一定的科学依据。     

中性蛋白酶水解鸡骨泥制备短肽工艺优化

为了探究酶法制备鸡骨泥短肽的最佳工艺,该文研究了以中性蛋白酶酶解鸡骨泥时各因素对短肽得率和羟自由基清除率的影响,以及鸡骨泥肽清除超氧阴离子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)的能力。试验探究了酶解过程中不同底物浓度、酶浓度、反应温度和反应时间对短肽得率和羟自由基清除率的影响,采用响应曲面优化得到了以短肽得率为目标的中性蛋白酶酶解鸡骨泥的最优工艺,当反应液p H值为7.2,反应温度42℃,反应时间2 h,底物质量分数5%,酶添加量200 mg/g,该条件下制备鸡骨泥肽,测得其短肽得率为56.16%,羟自由基清除率为54.12%。采用该酶解工艺制备鸡骨泥肽,测得其对超氧阴离子自由基最高清除率为56.01%,对DPPH自由基最高清除率为81.57%,说明鸡骨泥肽具有一定的抗氧化活性,研究结果为酶法制备鸡骨泥肽提供参考。     

响应面优化酶解法制备猪肩胛骨抗氧化肽工艺

为有效利用废弃猪骨制备抗氧化肽,以猪肩胛骨蛋白为原料,采用响应面分析法优化酶解猪肩胛骨蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。结果表明,以多肽得率和DPPH自由基清除率为评价指标,与未加酶处理组进行对比,筛选出风味蛋白酶为最优酶。在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,最终确立最优的酶解工艺参数为酶解时间4 h、酶解温度55℃、酶底比6 200 U·g~(-1)、底物浓度3%、pH值6.0。在此条件下DPPH自由基清除率为75.90%,测得的多肽得率为62.80%,其中R_(adj)~2=97.05%,R2=98.95%,表明该模型拟合程度较好。本研究结果对响应面优化酶解法制备猪肩胛骨抗氧化肽工艺具有一定的实践参考意义。     

酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽工艺

为优化酶解海蜇胶原蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,采用响应面分析法,研究了酶解温度,酶与底物的比值和pH值对此工艺的影响。以羟自由基清除率为响应值,最终确定温度47.3℃,酶与底物的比值2.8%和pH9.1。酶解液的羟自由基清除率为79.07%,与模型预测具有较好的拟合性。此工艺制备的酶解产物含有较高的疏水基氨基酸,相对分子质量主要分布在350～5000u之间,符合水解胶原蛋白的行业要求。     

南瓜籽粕酶法制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺优化

用中性蛋白酶水解南瓜籽粕,制备血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制肽,是南瓜籽粕蛋白深度开发的途径之一。为了探寻南瓜籽粕酶法制备ACE抑制肽的最佳工艺,该文以ACE抑制率为响应值,用响应面分析法研究酶浓度、底物质量浓度和水解时间等因素对酶解产物的ACE抑制活性的影响,优化制备工艺。结果表明,各因素对制备ACE抑制肽的活性具有极显著影响（P<0.001）。获得中性蛋白酶水解南瓜籽粕制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为：酶体积分数为4.8%、底物质量浓度为4.0g/100 mL、水解时间为320 min。在此条件下,南瓜籽粕蛋白酶解产物对ACE的理论抑制率最高可达80.0％,验证值为80.56％±0.23%,预测模型可靠性高,可应用于南瓜籽粕ACE抑制肽的酶法制备。通过优化,提高了南瓜籽粕ACE抑制肽的活性。     

脉冲超声辅助酶解制备大蒜降压因子

为了开发安全无毒副作用的食源性降血压活性物质,采取逐步分离及超声辅助酶解的方法筛选大蒜中具有降血压活性的功能因子,并采用响应面设计对超声辅助酶解方法进行了优化。研究结果发现,大蒜的多级分离物均具有一定ACE（血管紧张素转化酶）抑制活性,其中大蒜粉直接酶解产物降压效果最佳。以大蒜粉直接酶解物为目标产物,在底物浓度8%、脉冲超声工作时间3?s、间歇时间2?s的条件下优化得到超声处理参数为：超声处理时间72?min、处理液温度45℃、处理液pH值8.2,此条件下酶解产物的ACE抑制率为67.78%,其IC50（半抑制浓度）值为7.57?mg/ml,比常规酶解（无超声处理）降低了45.03%,说明经超声辅助酶解后产物的活性有大幅度提高。对大蒜ACE抑制因子进行SHR（原发性高血压大鼠）大鼠试验,推荐剂量150?mg/kg下灌胃3?h后,SHR大鼠血压下降18.8?mmHg。     

小黄鱼边角料的酶解工艺及酶解液性能研究

为开发利用小黄鱼边角料制备浓缩鱼汤,本研究采用酶解工艺对小黄鱼边角料进行酶解并对其酶解液的功能活性进行研究。以氨基酸态氮含量为指标,通过单因素及响应面试验探究酶制剂种类及添加量、pH值和酶解时间对酶解效率的影响;采用DEAE层析柱对酶解液进行分离纯化,SDS-PAGE凝胶电泳测定酶解多肽的分子量;通过测定酶解多肽对·OH和DPPH自由基的清除率、对细菌生长曲线的影响判断酶解多肽的抗氧化性和抗菌性。结果表明,以碱性蛋白酶为酶制剂,当酶与底物蛋白比为322 U·g^-1、固液比(m:v)为1:2、pH值为11.0、温度为55℃、酶解时间为2 h时,小黄鱼酶解液中氨基酸态氮含量为0.545 2 g·100g^-1;酶解液经DEAE柱分离得到了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四组多肽,其中组分Ⅲ多肽的分子量小于3.3 kDa;当酶解液中氨基酸态氮含量分别为8.62 和25.59 mg·mL^-1时,对·OH和DPPH自由基的清除率分别约为80%和61%;组分Ⅲ多肽对枯草芽孢杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有不同程度的生长抑制作用。本研究为小黄鱼边角料开发浓缩鱼汤及其他综合利用提供了依据。     

马面鱼皮胶原抗氧化肽的分离制备及稳定性研究

为促进对马面鱼皮资源的综合利用,开发高附加值产品,本试验以DPPH自由基清除率和水解度(DH)为评价指标,探讨马面鱼皮胶原蛋白的最佳酶解工艺,并采用超滤和凝胶柱层析法分离制备抗氧化肽,通过超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)法对其进行结构解析。此外,还探讨了pH值、温度及体外模拟消化对多肽抗氧化活性的影响。结果表明,利用双酶分步酶解法可制备高活性抗氧化多肽,即在底物浓度3%,加酶量3 600 U·g^-1以及温度50℃的条件下先用Proteasea A ‘Amano’2G酶解3 h,再用酸性蛋白酶酶解2 h,清除DPPH自由基的IC₅₀值为13.03 mg·mL ^-1。经超滤及柱层析分离后,可得到抗氧化活性较高的A₁组分,其清除DPPH自由基的 IC₅₀值为1.80 mg·mL^-1。稳定性研究结果表明,所制备的胶原蛋白抗氧化肽热稳定性好,在偏酸性条件下能保持较高的活性,经体外模拟胃肠消化后仍能保持较高的抗氧化活性。根据UPLC-MS分析推测A₁的氨基酸序列可能为Gly-Glu-Gly-Ala-Cys-Asn或Asn-Glu-Gly-Ala-Cys-Gly。本研究结果为马面鱼皮的高值化利用及高活性抗氧化肽的筛选提供了一定的理论依据。     

鳖甲胶原蛋白酶解物的分离纯化及体外抗氧化性研究

为建立中华鳖背甲中胶原蛋白酶解物(CH)的制备条件,并明确其体外抗氧化活性,本研究采用单因素试验探讨鳖甲胶原蛋白酶解物的分离条件。结果表明,其最佳提取工艺参数:胃蛋白酶添加量 4 000 U·g^-1、pH值2.5、酶解温度35℃。通过透析纯化后获得体外抗氧化活性最好的组分为分子量<50 kDa的样品。该样品经Sephadex G-75凝胶色谱分离纯化得到2个组分,其中GP-2组分对O2-·、OH·和DPPH·3种自由基清除能力最强;之后对GP-2组分进行离子交换层析分离同样获得2个组分,其中P1组分体外抗氧化活性高于GP-2,其对DPPH·、OH·、O2-·清除率分别为81.67%、65.45%和6.78%。经SDS-PAGE电泳确定P1组分的分子量约40 kDa。本研究结果为鳖甲的开发利用及鳖源新型抗氧化物质的研发提供了一定的理论基础。     

Antihypertensive effect of angiotensin i converting enzyme-inhibitory peptide from hydrolysates of Bigeye tuna dark muscle, Thunnus obesus

Angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide was isolated from tuna dark muscle hydrolysate prepared by alcalase, neutrase, pepsin, papain, alpha-chymotrypsin, and trypsin, respectively. Among hydrolysates, the pepsin-derived hydrolysate exhibited the highest ACE I inhibitory activity versus those of other enzyme hydrolysates. The structure of the peptide was identified to be Trp-Pro-Glu-Ala-Ala-Glu-Leu-Met-Met-Glu-Val-Asp-Pro (molecular weight 1581 Da) by time of flight mass spectrometry/mass spectrometry analysis, and the IC 50 value of the peptide was 21.6 microM. The Lineweaver-Burk plots revealed that the peptide acts as a noncompetitive inhibitor, and the inhibitor constant ( K i) was calculated as 26.6 microM using the secondary plots. The peptide had an antihypertensive effect according to the time-course measurement after oral administration to spontaneously hypertensive rats. Maximal reduction was detected 3 h after oral administration at a dose of 10 mg/kg of body weight. These results suggest that the peptide derived from tuna dark muscle would be a beneficial ingredient for functional food or pharmaceuticals against hypertension and its related diseases.     

复合酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的工艺研究

为了获得具有较高活性的抗冻肽,提高水产加工副产物的综合利用率,本试验以水解度和过氧化氢酶低温保护活性为指标,优化鱿鱼皮胶原蛋白酶解工艺,并对水解产物进行分离纯化及结构鉴定。结果表明,最佳酶解条件为：当底物浓度为4%、加酶量为4 000 U·g^-1时,先由碱性蛋白酶于pH值8、50℃条件下酶解2 h;灭酶后由木瓜蛋白酶于pH值6、45℃条件下酶解3 h。在此条件下所得酶解产物分子量主要在1 000～5 000 Da之间,经G-25凝胶柱分离后得到具有较高抗冻活性的F₂组分,其主要成分的氨基酸序列可能为Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。本研究为鱿鱼皮的精深加工和新型抗冻剂的开发提供了一定的理论依据。     

Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide derived from glycinin, the 11S globulin of soybean (Glycine max)

Angiotensin I-converting enzyme (ACE), a dipeptidyl carboxypeptidase, catalyzes the conversion of Angiotensin I to the potent vasoconstrictor Angiotensin II and plays an important physiological role in regulating blood pressure. Inhibitors of angiotensin 1-converting enzyme derived from food proteins are utilized for pharmaceuticals and physiologically functional foods. ACE inhibitory properties of different enzymatic hydrolysates of glycinin, the major storage protein of soybean, have been demonstrated. The IC50 value for the different enzyme digests ranges from 4.5 to 35 microg of N2. The Protease P hydrolysate contained the most potent suite of ACE inhibitory peptides. The ACE inhibitory activity of the Protease P hydrolysate after fractionation by RP-HPLC and ion-pair chromatography was ascribed to a single peptide. The peptide was homogeneous as evidenced by MALDI-TOF and identified to be a pentapeptide. The sequence was Val-Leu-Ile-Val-Pro. This peptide was synthesized using solid-phase FMOC chemistry. The IC50 for ACE inhibition was 1.69 +/- 0.17 microM. The synthetic peptide was a potent competitive inhibitor of ACE with a Ki of 4.5 +/- 0.25 x 10(-6) M. This peptide was resistant to digestion by proteases of the gastrointestinal tract. The antihypertensive property of this peptide derived from glycinin might find importance in the development of therapeutic functional foods.     

祁白术多酚酶法提取工艺优化及其抗氧化、抑制黑色素合成活性

为考察祁白术多酚(polyphenols from Atractylodes macrocephala Koidz grown in Qimen, AMP)的可利用性,采用响应面分析法优化酶法提取工艺,并研究AMP的抗氧化、抑制黑色素合成活性。结果表明,在料液比1:30 g·mL^-1、酶解时间20 min的条件下,当纤维素酶添加量为1.35%、酶解温度为44℃、pH值为4.7、搅拌转速为670 r·min^-1时,AMP提取量最高,为26.58±0.23 mg·g^-1。统计学分析显示,所选响应面模型拟合较好,优化后的提取工艺条件合理可行。AMP具有较好的抗氧化活性,其总还原力、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除作用随其浓度的增加而增强。当AMP浓度为0~0.02 mg·mL^-1时,对B16细胞无毒性作用。与α-MSH模型组相比,AMP显著下调了细胞内酪氨酸酶活性(P<0.05),并呈浓度依赖性地抑制细胞内黑色素的合成(P<0.05);当AMP浓度为0.02 mg·mL^-1时,对细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成抑制率分别为30.11%、43.35%,阳性对照熊果苷(0.1 mg·mL^-1)对细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的抑制率分别为22.03%、39.77%,表明AMP对黑色素生成的抑制效果强于熊果苷。本研究结果为祁白术多酚的综合开发利用提供了依据。