非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10⁷ CFU,次级文库总克隆数为1.6×10⁷ CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10⁷ cells·mL^-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本...     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。     

巨桉锌指结构蛋白基因EgrZFP7在低温胁迫中的功能研究

锌指结构蛋白(zinc finger protein,ZFP)是一类在植物生长、发育和逆境胁迫响应中发挥重要作用的转录因子。为了挖掘桉树(Eucalyptus)抗寒分子响应中的重要基因资源,为桉树抗低温分子辅助育种提供理论依据,本实验对巨桉(Eucalyptus grandis)在低温处理下受到强烈诱导表达的锌指结构蛋白基因Egr ZFP7(Eucalyptus grandis zinc finger protein 7)编码蛋白结构及其功能进行了研究。该基因是典型的C2H2型锌指结构蛋白基因,编码蛋白序列中含有2个锌指结构基序、1个L-Box基序和1个乙烯响应元件结合因子(ethylene response factor,ERF)相关双性抑制子(ERF-associated amphiphilic repression,EAR)基序。通过构建Egr ZFP7∷GFP表达载体,用基因枪轰击洋葱表皮的方法,进行基因表达蛋白的亚细胞定位,结果表明,Egr ZFP7表达蛋白定位于细胞核。构建35S∷Egr ZFP7超表达载体,转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),得到超表达转基因纯合株系Egr ZFP7-OX1和Egr ZFP7-OX2。与野生型相比,其正常生长条件下侧根的数目和长度增加。以-8℃低温处理3 d、再缓苗恢复3 d,结果显示,超表达转基因株系恢复速度慢,同时幼苗因受低温胁迫的死亡率远高于野生型,说明该基因超表达增加了拟南芥转基因植株的低温敏感性。酵母双杂交文库中筛选到1个与Egr ZFP7互作的乙烯响应因子蛋白Egr ERF4(Eucalyptus grandis ethylene response factor 4)。上述研究结果表明,Egr ZFP7可能通过与乙烯响应因子的相互作用,在巨桉低温胁迫响应中发挥负调控。本研究为进一步了解桉树抗寒分子机理提供了基础资料。     

独行菜LaBBX基因低温表达响应与密码子偏性分析

BBX是调控植物非生物胁迫相关基因表达,响应植物逆境胁迫的重要锌指蛋白类转录因子。为探究BBX在独行菜(Lepidium apetalum)幼苗耐受低温生长中的表达响应及其密码子偏好性,本研究基于独行菜转录组数据,筛选独行菜BBX编码基因的cDNA序列,并从独行菜幼苗中克隆获得全长733 bp的基因编码区序列,命名为LaBBX。序列分析表明,LaBBX由242个氨基酸组成,包含2个B-box锌指蛋白结构域,蛋白分子量为61.66 kDa,等电点为5.09,无信号肽和跨膜区。独行菜幼苗受低温胁迫时,LaBBX基因显著上调表达,6 h上调表达至21倍,且24 h内均呈现高水平表达,说明该转录因子可能在独行菜幼苗受低温胁迫时起重要作用。偏好性分析结果显示,独行菜LaBBX基因的ENc、CAI值和GC含量分别为55.453、0.244和46.78%,其密码子使用偏性较弱,相对偏好使用AT,高频密码子有8个,CDS序列及RSCU聚类分析中与十字花科植物最相近;其偏好性的形成与突变和自然选择等诸多因素相关,酵母菌表达系统更适合作为LaBBX基因的异源表达受体,拟南芥是适宜LaBBX基因的遗传转化受体。本研究为了解独行菜LaBBX基因的异源表达及基因功能提供了重要参考。     

红花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆与表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是植物代谢过程中的一个关键酶。为了探究SAMS在红花逆境胁迫方面的作用,本研究根据红花转录组数据从红花品种豫红花1号克隆得到1个SAMS的全长cDNA序列,命名为CtSAMS1,并对其进行生物信息学分析、组织表达特性分析及非生物胁迫和激素诱导表达分析。结果表明,红花CtSAMS1基因的开放阅读框(ORF)长1 173 bp,编码390个氨基酸,其蛋白分子质量为42.7 kDa,蛋白保守区预测表明CtSAMS1具有甲硫氨酸腺苷转移酶的保守结构域,属于S-腺苷甲硫氨酸合成酶家族。系统进化分析显示CtSAMS1与来自菊科的SAMS亲缘关系较近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果表明,CtSAMS1基因在花和茎中表达量最高,在其他组织部位中表达量极低;CtSAMS1基因表达量随着花瓣衰老程度的增加而升高。盐、干旱和低温胁迫均能够诱导CtSAMS1基因的表达,茉莉酸甲酯、水杨酸、脱落酸能够诱导红花花瓣中CtSAMS1基因表达,赤霉素对CtSAMS1基因表达有一定的抑制作用。本研究为进一步研究CtSAMS1在红花中的抗逆机制,以及为培育红花抗逆新品种奠定了理论基础。     

小麦乙烯转录因子TaERF2响应湿害胁迫的表达分析

乙烯响应因子在植物非生物胁迫应答中起重要作用。为了解TaERF2在小麦湿害胁迫下作用的分子机理,本研究对TaERF2基因及其编码蛋白序列特征进行分析,并检测TaERF2在不同耐湿品种中的表达特征及原核表达。结果表明,TaERF2基因含有2个外显子和1个内含子,编码355个氨基酸序列,具有典型的AP2/ERF保守结构域和YRG、RAYD基序。AP2/ERF家族转录因子进化和同源比对分析表明,TaERF2属于AP2/ERF家族B2组,与拟南芥AtRAP2.12、AtHRE1和水稻OsSNORKEL1、OsSNORKEL2有较高的同源性,且启动子区域含有缺氧厌氧顺式元件,推测TaERF2可能为湿害胁迫响应基因。湿害胁迫后,TaERF2在小麦根系中特异表达,在耐湿小麦品种宁麦9号根系中的表达显著上调,2~4 h表达量达到最高,然后显著降低,而在不耐湿小麦品种郑麦1354根系中的表达无显著上调。原核表达结果显示,TaERF2可以快速响应ZPTG刺激诱导,与上述宁麦9号根系中的表达模式相似,表明TaERF2在小麦耐湿中具有重要调节作用。本研究为解析小麦耐湿分子调控机制提供了理论参考。     

烟草WRKY12基因的分离、表达与多克隆抗体的制备

在高等植物中,WRKY转录因子家族成员广泛参与植物的生长发育、代谢、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程的调控.本研究采用同源序列克隆的方法获得烟草WRKY12基因,序列分析表明,该蛋白属于WRKY家族第2类成员,只有一个WRKY结构域,锌指结构为C-X4-C-X23-H-X1-H.构建系统发育树结果表明,它与大豆中GmWR...     

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因As-1-SST的克隆与表达分析

植物果聚糖是一类重要的可溶性碳水化合物,其在植物中的积累可提高植物的抗逆性。为了解大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的序列特征和功能,本研究采用TA克隆方法(Original TA Cloning Kit)得到乐都紫皮大蒜As-1-SST基因全长序列,利用BLAST、DNAMAN、ProtParam、SWISS-MODEL、MEGA等生物信息工具分析其序列特征,通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析As-1-SST基因在大蒜根、假茎、叶片和鳞芽中的表达差异及其对低温和干旱胁迫的响应情况。结果表明,大蒜As-1-SST基因全长1 872 bp, 编码623个氨基酸,推测蛋白质分子质量为69.76 kDa,理论等电点为5.19,为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果显示,As-1-SST蛋白主要定位于液泡,该蛋白无信号肽,包含2个特异位点,属于糖苷水解酶32(GH32)家族。在进化关系上,大蒜As-1-SST与百合科的洋葱1-SST亲缘关系最为接近。qRT-PCR分析表明,As-1-SST基因在根中的表达量最高,其次是假茎,在鳞芽和叶片中表达水平较低,具有明显的组织特异性;不同组织As-1-SST对于低温及干旱胁迫的响应差异显著,低温胁迫显著诱导了根、假茎、叶片中As-1-SST的表达,而干旱胁迫只显著提高了鳞芽中As-1-SST的表达量,说明大蒜各组织As-1-SST对逆境信号的响应机制不同。本研究为进一步鉴定大蒜果聚糖合成酶基因的生物信息学功能和表达调控机制提供了一定的理论依据。     

小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D的耐盐性分析

胁迫相关蛋白（SAPs）是一类具有A20/AN1锌指结构域的蛋白,在植物中主要参与逆境胁迫响应。为探究小麦胁迫相关蛋白基因TaSAP12-D在耐盐胁迫中的功能,本研究以小麦品种旱选10号为试材,克隆得到TaSAP12-D基因,利用农杆菌瞬时注射烟草叶片进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行不同组织和盐胁迫条件下的表达模式分析,利用蘸花法将TaSAP12-D转化到拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）中并进行耐盐性分析。结果表明,TaSAP12-D基因全长519 bp,编码172个氨基酸,预测蛋白分子量为18.41 kDa,等电点为9.21。亚细胞定位显示,TaSAP12-D在烟草细胞核和细胞质中均有表达。qRT-PCR结果显示,TaSAP12-D在小麦萌发期和幼苗期的胚芽、根和叶中均有表达,其中在幼苗期的叶中表达量最高。在盐胁迫条件下,TaSAP12-D的表达量显著上调。在150 mmol·L-1NaCl处理条件下,过表达TaSAP12-D拟南芥的存活率显著提高,表明TaSAP12-D可以增强转基因拟南芥的耐盐性。另外,在转基因拟南芥中盐胁迫相关...     

玉米生长素响应因子基因家族全基因组鉴定及表达分析

生长素响应因子(ARF)在植物中可以特异性结合在应答基因的启动子区域,调控植物的生长发育。为了进一步了解玉米ARF基因家族的数量、基本特征、进化关系及响应非生物胁迫和激素的表达模式,本研究在全基因组水平,通过生物信息学方法鉴定玉米ARF基因家族,分析了蛋白理化性质及系统发育,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析了4个ZmARFs基因的时空表达模式及高温、干旱、盐和脱落酸(ABA)处理下的表达情况。结果表明,玉米36个ARFs基因随机非均匀分布在9条染色体上,编码氨基酸长度、分子量、等电点及二级结构存在很大的差异。高粱、水稻、拟南芥和玉米的蛋白复合进化树显示共分为Ⅰ~Ⅳ四大类,玉米与高粱ARF蛋白亲缘关系最近,而与拟南芥ARF蛋白亲缘关系最远,且玉米中发生基因内和基因间复制现象。启动子顺式作用元件主要是干旱、低温、氧化和激素类响应元件。RT-qPCR结果显示,ZmARF1、ZmARF6、ZmARF13和ZmARF22基因均在雄穗分支和胚中表达量较高,在花粉中表达量较低;4个基因(除ZmARF22)在高温、干旱、盐和ABA诱导时均显著上调表达。亚细胞定位表明上述4个基因编码的蛋白质均定位于细胞核。本研究结果为揭示玉米ARF蛋白功能和挖掘玉米的抗逆基因提供了理论基础,为抗逆育种提供了分子资源。     

辣椒泛素结合酶变体类似蛋白基因克隆及其与氮吸收利用的相关性分析

UEVs蛋白是泛素结合酶E2的变体,可通过与E2形成复合物催化底物泛素化。为探究UEVs蛋白在氮吸收利用中的作用,本研究参考辣椒低氮胁迫相关转录组数据,利用反转录PCR方法从辣椒叶片中克隆了泛素结合酶变体类似蛋白基因,命名为CaUev1D-L,对其进行生物信息和系统进化分析,并对转CaUev1D-L基因烟草进行低氮胁迫后的表型和生理特性分析。结果表明,CaUev1D-L开放阅读框长402 bp,编码133个氨基酸,具有E2结合酶UBC结构域,比辣椒、烟草、番茄和马铃薯等茄科作物的Uev1D蛋白氨基酸序列末端少14个氨基酸,与Uev1D蛋白的UBC结构域存在6个氨基酸的差异,与辣椒等作物的Uev1D蛋白不在同一进化分支。将CaUev1D-L转入烟草,在正常氮素水平下,转基因植株的茎叶干重显著小于野生型植株;在低氮水平下,转基因烟草植株的茎叶干重和根干重均显著大于野生型植株。本研究结果为氮吸收利用分子机制研究和相关基因的发掘利用提供了参考。     

谷子GRAS转录因子家族的全基因组鉴定、表达分析及标记开发

为了鉴定谷子GRAS家族基因并揭示SiGRASs响应外源植物激素和逆境胁迫过程的表达规律,本研究采用生物信息学方法对谷子GRAS转录因子家族进行全基因组鉴定,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行4种激素和2种胁迫处理后的表达分析,并根据SiGRAS23序列差异开发分子标记。结果表明,谷子全基因组共包含52个GRAS转录因子基因,大部分编码亲水性蛋白;82.69%的基因编码酸性蛋白,长度为362~734 aa,分子量为39.81~100.09 kDa,等电点为4.85~9.53。系统发育分析将谷子GRAS家族划分为10个亚家族。组织表达量分析表明,各亚族基因具有明显的组织表达特异性,LISCL、DELLA和SHR亚族基因分别在叶、茎和根中有较高的表达量,PAT1和HAM亚族大部分基因为组成型表达,但在叶中的表达量最高。SiGRASs启动子区含有多种植物激素、逆境响应相关的顺式作用元件;qRT-PCR结果显示,SiGRASs在不同激素和非生物胁迫下的表达水平存在较大差异,其中PAT1亚族中Seita.2G369400对6种不同的处理响应最为敏感;少数SiGRASs基因在各组织和各种激素和非生物胁迫处理下,表达量均在极低水平。DELLA亚族中的SiGRAS23在遗传群体AJF₅的双亲矮宁黄和晋谷21号间存在序列差异,据此开发的分子标记D8-1与该群体株高性状紧密连锁。本研究为解析谷子GRAS家族基因参与激素信号转导及逆境胁迫响应的功能研究奠定了基础,SiGRAS23的分子标记可用于今后谷子种质资源株高等位变异的筛选。     

番茄SlJAZ11的表达分析及互作蛋白的筛选与验证

茉莉酸（JA）参与调节植物生长、发育和防御等多种重要生物过程,其中JAZ蛋白作为抑制子,在茉莉酸介导的生物和非生物胁迫响应过程中起到重要作用。为研究SlJAZ11的功能,本研究分析了水杨酸（SA）、茉莉酸等激素以及病原菌侵染处理后SlJAZ11的表达模式。结果表明,SlJAZ11能够响应水杨酸、茉莉酸及丁香假单胞菌（Pst DC3000）的诱导。通过酵母双杂交筛选番茄cDNA文库,获得了14个SlJAZ11潜在的互作蛋白。进一步采用酵母双杂交点对点验证和双分子荧光互补技术（BiFC）对候选的SlENT、SlOOLG与SlJAZ11间的互作关系进行验证,发现SlENT和SlJAZ11存在互作。对SlENT的表达模式进行分析,发现其表达被SA和Pst DC3000显著抑制,而MeJA能显著诱导其表达,表明SlJAZ11可能通过与SlENT互作来调控JA介导的番茄抗病性。本研究可为阐明SlJAZ11功能与作用机制奠定良好的分子基础。     

黄瓜果实CsMYB62克隆及其对CsGR-RBP3表达的调控

本研究前期证实,低温诱导的CsGR-RBP3表达与黄瓜果实耐冷性密切相关,但调控其表达的具体机理尚不清楚。为鉴定调控CsGR-RBP3表达的MYB转录因子,本研究采用转录组测序,分析了黄瓜果实在5℃低温处理后的转录组变化,并通过共表达趋势分析,鉴定了与CsGR-RBP3表达趋势一致的MYB基因。结果发现,CsMYB62与CsGR-RBP3表达的相关性很高,且低温处理能诱导黄瓜果实CsMYB62和CsGR-RBP3表达,推测CsMYB62转录因子可能调控CsGR-RBP3表达。为进一步分析CsMYB62基因的功能,从黄瓜果皮中克隆了CsMYB62基因全长序列。结果显示,CsMYB62基因全长834 bp,编码277个氨基酸残基。CsMYB62蛋白含有SANT保守域和MYB DNA结合域,定位在细胞核,在进化过程中高度保守。CsMYB62蛋白具有转录激活活性,能直接绑定到CsGR-RBP3启动子,增强CsGR-RBP3启动子活性,表明CsMYB62通过直接调控CsGR-RBP3表达而增强黄瓜果实耐冷性。本研究结果丰富了MYB调控网络,为进一步解析CsMYB62功能奠定了理论基础。     

基于液质联用技术的坛紫菜甘油-3-磷酸胁迫响应分析

甘油-3-磷酸作为渗透压调节物红藻糖苷的合成前体物,参与藻类抗逆应答过程。为了解坛紫菜的抗逆机制,通过超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-MS)建立甘油-3-磷酸的定量分析方法,分析非生物(温度、盐度和干出)胁迫下的甘油-3-磷酸响应规律。结果表明,温度胁迫1 h后,甘油-3-磷酸的含量快速变化,当温度高于23℃时,甘油-3-磷酸含量与胁迫温度成正比,而在12℃低温下,甘油-3-磷酸的含量反而下降;盐度胁迫促使甘油-3-磷酸的含量快速上升,且高盐胁迫下的变化显著高于低盐环境;而短时间1 h干出胁迫后的甘油-3-磷酸含量略有上升(1.19倍,与对照组相比),但随着干出时间继续延长,甘油-3-磷酸含量总体呈现下降趋势。温度、盐度和干出胁迫后的坛紫菜进行恢复培养后,甘油-3-磷酸含量均趋于对照组水平。综上可知,甘油-3-磷酸可快速响应环境胁迫,这为坛紫菜红藻糖苷抗逆机制的多层次研究奠定了基础。