脱落酸对番茄部分果实性状和营养品质的影响

为研究脱落酸(ABA)对番茄果实品质的影响,本研究测定了番茄ABA生物合成缺失突变体not和flc及其野生型各成熟时期果实,以及外源100 μmol·L^-1 ABA处理后不同天数的番茄果实的外观品质和营养品质。结果表明,内源ABA缺失抑制番茄果实增重并促进果实纵向生长,但对果实硬度无明显影响。同时,内源ABA可影响番茄果实可溶性固形物含量并促进破色期和转色期的还原糖积累。not和flc果实中番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素和总类胡萝卜素含量均显著高于其野生型,且外源喷施试验表明,与对照组相比,外源100 μmol·L^-1 ABA处理能显著抑制番茄果实中番茄红素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的积累。综上,ABA在调控番茄果实外观品质方面,可促进番茄果实增重并抑制番茄果实纵向生长;在调控番茄果实营养品质方面,可促进还原糖积累并抑制类胡萝卜素积累。本研究结果为利用ABA调控番茄果实品质提供了一定的理论依据和技术支持。     

油菜素内酯合成酶基因表达与葡萄果实发育关系研究

为研究葡萄早熟机制,以鄞红葡萄及其3株成熟期较早的变异株系甬紫晶、甬早红与甬妃红为材料,测定植株不同发育时期油菜素内酯(BRs)的含量以及其生物合成途径中的关键酶基因的表达量。结果表明,甬紫晶与甬早红的BRs含量高峰期早于鄞红,甬妃红的BRs含量略高于鄞红,这可能是影响早熟的主要因素;相关性分析表明,在葡萄果实生长发育过程中,BRs含量与DET2和CPD 2个基因的表达量正相关,DET2可能是BRs生物合成过程中的关键酶,CPD对BRs生物合成起辅助作用。本研究结果对葡萄成熟调控等实际生产具有重要的指导意义。     

铜胺氧化酶基因PpCuAO4在桃成熟中的功能鉴定

为明确铜胺氧化酶(CuAO)在桃果实成熟过程中的作用,分别采用1.0、5.0和10.0 mmol·L^-1的CuAO抑制剂氨基胍(AG)对黄水蜜桃果实进行喷施处理,并于桃果实成熟后测定果实硬度。结果表明,5 mmol·L^-1 AG处理组桃果实的硬度保持效果最好。进一步采用5.0 mmol·L^-1 AG处理黄水蜜桃果实,并测定果实成熟相关生理指标。结果表明,AG处理下桃果实在采后7 d内果实硬度均显著高于对照水平,乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平,表明抑制CuAO介导的多胺分解可显著延缓桃果实成熟。AG处理显著抑制乙烯合成、生长素转运和细胞壁降解相关基因PpACO1、PpACS、PpPIN1、PpGH3.3、PpPG和PpPME1的表达水平。为进一步明确CuAO在桃成熟中的功能,利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默腐胺(Put)分解关键基因PpCuAO4。结果显示,转基因桃果实PpCuAO4表达水平仅为对照的18%,Put含量和果实硬度显著高于对照水平,而乙烯释放量和呼吸强度均显著低于对照水平。上述结果表明,PpCuAO4介导的Put分解可以促进桃果实成熟。本研究为进一步深入解析多胺(polyamine)调控桃果实成熟的机制提供了重要的理论依据。     

月季花瓣中农杆菌介导的基因瞬时表达体系的优化及其在RNAi中的应用

在植物中通过农杆菌介导的基因瞬时表达和基于RNAi的基因沉默可便捷高效地研究基因功能。本研究采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)注射侵染法,利用GUS作为报告基因,探讨了月季(Rosa hybrida)品种、农杆菌菌株、开花级别、花瓣位置、农杆菌侵染浓度和侵染液成分等因素对月季花瓣中基因瞬时表达效果的影响。结果表明,月季品种蜜糖3级切花的中层花瓣中瞬时表达效果最佳;农杆菌菌株GV3101介导的瞬时表达效果最好,侵染浓度以OD600=0.9为宜,添加10 mmol/L MgCl2及10 mmol/L MES的侵染液效果优于重蒸水。同时,利用上述优化瞬时表达体系进行RNAi沉默,成功抑制了外源报告基因GUS和内源基因RhSAG的表达。相比对照,RhSAG沉默花瓣的萎蔫速度较慢,说明衰老进程得到延缓。该体系的优化为月季花瓣中基因功能的鉴定提供了有效工具。     

草莓果实中BG基因的克隆及功能分析

脱落酸(abscisic acid,ABA)能促进草莓(Fragaria×ananassa)果实的发育成熟,葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)能通过水解ABA葡萄糖酯(ABA glucose ester,ABA-GE),把非活性的ABA转换成有活性的ABA,因此,BG参与果实发育进程.但是目前还没有遗传学证据来揭示BG对果实发育的作用机理.为了研究BG在果实发育中的作用,本实验以草莓品种甜查理为试材,通过PCR分子克隆的方法分离到3个编码BG的基因FaBG1、FaBG2和FaBG3;首先对3个基因进行生物信息学、时空表达分析,以及测定果实内源ABA含量的变化;其次通过分子调控FaBG3基因的表达量影响果实内源BG的活性,分析草莓果实的生理指标以及与ABA信号路径、色素代谢和细胞壁代谢相关基因的表达水平.实验结果表明,BG蛋白含有一个BglB区域,是能水解其他的复合物的特异区域.随着草莓果实的发育成熟,ABA的含量逐渐升高,FaBG1基因的表达量一直很低,FaBG2的表达量呈总体的下降趋势,只有FaBG3的表达量与ABA含量变化相一致.利用RNA干扰技术调低草莓果实中FaBG3基因的表达量也下调了FaBG1和FaBG2的表达量,同时降低了果实中BG的活性,导致果实中ABA含量、果实色素和可溶性固形物含量降低,提高了果实的硬度等生理指标,与生理指标相关的如色素代谢基因查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)、类黄酮-3-羟化酶(flavonoid-3-hydroxy-lase,F3H)、类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP Glc-flavonoid 3-O-glucosyl transferase,UFGT)和二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavo-nol-4-reductase,DFR),果实软化基因果胶甲酯酶(pectin methylesterase,PE)、伸展蛋白(expansin,EXP)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)和果胶酸裂解酶(pectate lyases,PL),果实香味代谢基因醌氧化还原酶(quinone oxidoreductase,QR)、酰基转移酶(alcohol acyltransferase,AT)和ABA信号路径中的基因抗副球菌素蛋白(pyrabatin resistance,PYR)、ABA不敏感体1(ABA insensitive 1,AB11)、ABI3、ABI4和ABI5的表达量等分子指标也出现了不同程度的变化,最后导致了果实延迟成熟.与此相反,FaBG3基因超表达的草莓果实出现了提前着色成熟的现象.果实生理及分子指标的变化可揭示BG调控草莓果实发育进程的机理.     

亚洲棉NCED3基因克隆及其抗旱功能分析

9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是脱落酸(ABA)合成过程中的关键限速酶,被证实广泛参与植物的生长发育进程及对非生物胁迫的应答。为了挖掘、鉴定棉花抗旱相关的NCEDs基因,本研究克隆了亚洲棉(Gossypium arboreum)GaNCED3基因,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了干旱胁迫下该基因的表达特性;并遗传转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究了该基因在干旱应答中的功能。结果显示,GaNCED3基因开放阅读框(ORF)全长为1 794 bp,其编码的蛋白质包含597个氨基酸。该基因在干旱胁迫处理后上调表达,在处理3 h的根中表达量最高,是对照的27.6倍。在萌发期进行甘露醇模拟的干旱处理,超表达GaNCED3的转基因拟南芥种子萌发率和绿苗率均高于野生型。在幼苗期进行自然干旱处理后,转基因拟南芥植株叶片丙二醛含量显著低于对照(P<0.05),游离脯氨酸积累量显著高于对照(P<0.05)。本研究初步证明了外源超表达GaNCED3基因使植株抗旱能力增强,为进一步研究GaNCED3干旱应答的分子机制提供了理论依据,为抗旱育种提供了候选基因资源。     

枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。     

不同处理对海沃德猕猴桃内源ABA相关代谢基因表达的影响

为在分子水平阐明外源乙烯利、1-MCP和ABA处理对海沃德猕猴桃内源ABA合成代谢的影响,并揭示ABA调控果实后熟机理。本研究以海沃德猕猴桃果实为试验材料,利用外源乙烯利、1-MCP和ABA处理猕猴桃果实,分别运用高相液相色谱(HPLC)和RT-qPCR分析20℃贮存条件下对猕猴桃内源ABA合成、信号通路相关基因XanDH、PYR/PYL、PP2C、ABF的表达量影响。结果表明,乙烯利处理下PP2C和ABF基因表达量在DAH17~DAH58都显著低于对照组,XanDH和PYR/PYL在DAH17均显著高于对照组,而后迅速回落。在ABA处理下XanDH基因表达量呈先下降后上升再下降的趋势,在DAH17表达量最高。PP2C和PYR/PYL在DAH17经历高峰后逐渐回落至低水平,与对照组差异显著。ABF在采后前期有较高的表达量,经历峰值后急速回落,在后熟中后期表达水平较低。1-MCP处理下,在整个后熟阶段,XanDH的表达量均显著高于对照组,在DAH17达到最大值,随后逐渐降落。与对照组相比,PP2C基因表达量持续上升,ABF基因持续下调;PYR/PYL在DAH17表达量最高而后下调,但仍显著高于对照组。表明乙烯利、1-MCP、ABA处理对海沃德猕猴桃内源ABA合成、信号传导有较大影响,本试验结果为进一步探究外源乙烯利、1-MCP和ABA对猕猴桃果实采后衰老的调控作用及机理提供了一定的理论依据。     

过表达野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因GsSAMS提高水稻耐盐碱性

S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)是生化反应中合成甲基供体的关键酶,在植物逆境响应中具有重要的作用。为了鉴定野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶GsSAMS基因对水稻盐碱胁迫耐性的影响,本研究采用USER克隆技术构建植物过表达载体,以农杆菌介导法侵染水稻愈伤组织,经过PCR、半定量PCR(RT-PCR)等分子检测获得GsSAMS转基因水稻株系;通过对比野生型和转基因水稻盐碱胁迫处理后的表型、存活率及过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性等指标,发现GsSAMS转基因株系耐盐碱性显著优于野生型。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现盐碱胁迫处理后,OsM6PR1、OsNAC5、OsPOX1基因在转基因株系中的表达显著高于野生型,说明GsSAMS可通过提高抗氧化物酶POD和CAT活性及相关基因的表达,增强转基因水稻盐碱胁迫耐受性。本研究获得的耐盐碱水稻新株系对盐碱地的开发利用具有重要意义。     

葡萄VvERF90的克隆及对乙烯合成基因的调控研究

ERF转录因子为植物特有的一类转录因子,在调控植物乙烯合成过程中发挥着重要功能。为研究葡萄ERF转录因子在调控乙烯合成过程中的作用,以阳光玫瑰(Vitis labruscana Baily × V. vinifera L.)葡萄穗梗为材料,克隆了乙烯响应因子VvERF90,并进行了生物信息学分析和基因功能分析。结果表明,VvERF90属于第IX亚家族,与苹果MdERF2和MdERF3的亲缘关系较近;VvERF90可以正调控VvACO1的表达;VvERF90在拟南芥中过量表达后,转基因植株中VvACO1的同源基因AtACO3基因表达量明显升高,转基因植株的乙烯释放量增加2倍,植株变矮。上述结果表明,VvERF90可能通过调节VvACO1的表达,调控乙烯的释放水平。本研究结果为进一步探明葡萄中乙烯合成的调控机制奠定了理论基础。     

CRISPR/Cas9靶向敲除番茄SNAC4/9突变体的构建、鉴定及分析

NAC转录因子参与植物生长发育、果实色素积累、细胞壁形态形成和植株衰老等过程。为系统研究SNAC4(SlNAC48,基因ID:101247735)和SNAC9(SlNAC19,基因ID:101248665)在番茄成熟衰老进程中的精准功能,本试验设计SNAC4/9敲除靶点,通过重叠聚合酶链式反应（overlapping PCR）法构建单引导RNA(sgRNA)表达盒,采用金门分子克隆（golden gate）方法将单个或多个sgRNA表达盒组装至pYLCRISPR/Cas9载体。PCR和测序结果表明,SNAC4/9敲除载体构建成功,通过农杆菌转化法将编码Cas9蛋白和sgRNA的基因导入Micro-Tom番茄细胞,对阳性苗进行靶点和脱靶位点检测,结果表明番茄成功突变且未脱靶,通过鉴定T1代突变体进一步证明,CRISPR/Cas9基因编辑番茄的靶点在代际之间可以稳定遗传。与野生型相比,SNAC4/9敲除果实色素积累减少,成熟延迟,表明SNAC4/9在番茄果实成熟中发挥重要作用。本研究为进一步探究SNAC4/9调控番茄果实色素代谢和胞壁代谢机制提供了遗传材料和试验基础。     

Changes in the free amino acid composition with maturity of the noble cultivar of Vitis rotundifolia Michx. grape

The changes in amino acid composition that occur with maturity of the Noble cultivar of the Vitis rotundifolia Michx. (muscadine) grape were determined by HPLC. Eighteen amino acids were identified. Histidine was the most prominent amino acid followed by alanine. The concentrations of most of the major amino acids (alanine, glycine, histidine, valine, isoleucine, aspartic acid, and serine) were highest at verasion. Glutamine and threonine contents dropped sharply after fruit set, while those of arginine and proline increased gradually with maturity and ripening. Tyrosine content increased gradually with maturity and ripening following a slight drop after fruit set. In ripe grapes, seeds contained most of the amino acids in mature grapes (50%) followed by the pulp (23%), the juice (15%), and the skin (11%). Alanine, histidine, and arginine were the principal amino acids identified in the juice. Alanine, histidine, arginine, valine, glutamine, aspartic acid, proline, serine, and threonine accounted for about 90% of the amino acids in the pulp. In seeds, alanine, proline, asparagine, and histidine accounted for over 55% of the amino acids, while alanine and histidine were found to be the predominant free amino acids in the skin. The profile indicates some differences in the changes in amino acid composition with berry maturity and relative amounts of amino acids present in muscadine compared to those in nonmuscadine grape species.     

猕猴桃AdMSD1和AdMSD2的克隆及其在果实后熟软化中的表达

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)在植物生长发育与衰老及应对逆境胁迫中发挥重要作用。为探究MnSOD基因在猕猴桃果实后熟软化及采后贮藏过程的作用,本研究以米良1号猕猴桃为试材,克隆了2个MnSOD基因,分别命名为AdMSD1和AdMSD2。AdMSD1包含675 bp的开放阅读框(ORF),编码224个氨基酸,登录号为KY471358;AdMSD2包含690 bp的ORF,编码229个氨基酸,登录号为KY471359。生物信息学分析结果表明,AdMSD1和AdMSD2均编码稳定的碱性亲水蛋白,包含保守金属结合域DVWEHAYY、Mn²⁺金属结合位点和特征氨基酸。AdMSD1和AdMSD2均由6个外显子和5个内含子组成。进化树结果显示,2个蛋白聚在双子叶植物组的不同分支,属于MnSOD家族的不同成员。定量分析结果表明,AdMSD1在叶片的转录水平最高,在花中的转录水平最低;AdMSD2在花中的转录水平最高,在成熟果中的转录水平最低。2个基因在果实后熟软化过程的转录呈动态变化,但均在软化初期上调,软化Ⅰ期和Ⅱ期下调,进入软化Ⅲ期后再次回升。果实中AdMSD1和AdMSD2的转录水平均在低温贮藏过程中下降。AdMSD1在脱落酸处理的第1和第5天表达上调,而AdMSD2在脱落酸处理后表达下调;AdMSD1在赤霉素处理后表达下调,而AdMSD2在赤霉素处理的第1天表达上调,之后下调。研究结果表明,AdMSDs基因参与猕猴桃果实的后熟软化和采后贮藏过程,为进一步研究SOD在猕猴桃果实采后品质调控中的作用机制奠定了基础。     

Fruit maturity and juice extraction influences ellagic acid derivatives and other antioxidant polyphenolics in muscadine grapes

Polyphenolic compounds including ellagic acid, ellagic acid derivatives, and anthocyanins were characterized and quantified by novel chromatographic conditions in eight muscadine grape (Vitis rotundifolia) cultivars and evaluated for antioxidant capacity as influenced by two ripening stages and their location within the fruit (skin, pulp, and juice). All polyphenolics generally increased as fruit ripened and the highest concentrations were located in the skins. Free ellagic acid, ellagic acid glycosides, and total ellagic acid ranged from 8 to 162, 7 to 115, and 587 to 1900 mg/kg, respectively, in the skin of ripe grapes. Hot-pressed juices contained considerably lower polyphenolic concentrations than were present in whole grapes. Five anthocyanidins were present in each cultivar in variable concentrations (delphinidin > petunidin > malvidin + peonidin > cyanidin). Antioxidant capacity was appreciably influenced by cultivar, maturity, and location in the fruit with good correlations to soluble phenolics found in both methanolic and ethyl acetate extracts (r = 0.83 and 0.92, respectively).     

采前喷施脱落酸对欧李果实品质的影响

为探究采前喷施脱落酸(ABA)对欧李果实品质的影响,本研究选择农大6号和农大7号2个欧李品种为试验材料,在喷施不同浓度和不同次数的ABA后测定成熟果实的单果重、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、类黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力。结果表明,喷施不同浓度和不同次数的ABA后,农大6号欧李果实可滴定酸含量、类黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力降低,对于可滴定酸含量而言,喷施2次比喷施1次的降酸效果明显,而类黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力受ABA浓度和喷施次数的变化影响不大。各处理下农大7号欧李果实的单果重和可溶性固形物含量均得到了升高,类黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力受ABA浓度和喷施次数的变化影响较大。根据主成分分析进行排名可知,不同浓度不同次数的脱落酸处理后农大6号欧李果实综合评分均低于对照,果实综合品质下降,农大7号欧李果实综合评分均高于对照,当脱落酸浓度为25 mg·L^-1,喷施次数为1次时对果实综合品质的提升效果最好。本研究为提升欧李果实品质选取喷施适宜浓度和次数的ABA提供了理论基础。     

朱红橘果实成熟过程中类胡萝卜素的积累及相关基因的表达分析

为探究朱橘类果实成熟过程中类胡萝卜素的积累及相关基因的表达模式,本研究以朱红橘为材料,使用手持色差仪测定果实成熟过程中果皮和果肉的色差值,利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测类胡萝卜素组分的含量变化,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析类胡萝卜素代谢相关基因的表达.结果表明,朱红橘成熟过程中,果皮和果...     

施钾时期对葡萄转色和品质及钾吸收基因表达的影响

  【目的】  钾肥可促进葡萄果实的提前着色,本研究比较了不同时间施用钾肥对葡萄转色和品质的影响,并从分子水平初步验证了钾肥施用时期对葡萄转色的效果。  【方法】  以江苏盱眙、浙江天台和浙江金华3个地区的5年生‘夏黑’葡萄为试材,分别在果实膨大后4 (T1)、8 (T2)、12 (T3)、16 (T4)天的上午10:00,沟施120 g/株 K₂SO₄水溶肥,以不施钾肥为对照。在每次处理前观察果实颜色,处理后每隔4天统计果实转色率,并采集30粒果实用于测定果实纵横径、果粒重、硬度、可溶性固形物(SS)、可滴定酸(TA)等生理指标。于施肥处理前1 h (上午9:00),采集葡萄第8～9节位成熟叶片4～5片,用于检测VvKUP1、VvKUP2荧光定量相对表达量。  【结果】  4个施肥时期沟施120 g/株钾肥后,3个地区施肥处理均促进了葡萄果实提前转色。与对照相比,在江苏盱眙和浙江金华均以T3处理促进着色效果最好,果实分别提前4和8天左右着色,转色率分别达到95.0%和80.6%;在浙江天台以T2处理促进果实着色效果最好,提前4天左右着色,转色率达到83.4%。沟施钾肥可以促进果粒重和纵横径的增加,在江苏盱眙和浙江金华均以T3处理最好,在浙江天台以T1处理最好。在江苏盱眙,4个沟施钾肥处理均提高了果实可溶性固形物含量,T2、T3、T4处理降低了果实硬度;在浙江金华地区,4个施钾处理均降低了果实可滴定酸含量和果实硬度,提高了可溶性固形物含量;在浙江天台,沟施钾肥降低了果实可滴定酸含量和果实硬度,T1、T2、T3处理提高了可溶性固形物含量。通过对不同时期‘夏黑’葡萄叶片中钾吸收基因的表达分析,发现当钾吸收基因VvKUP1表达趋势由下降转为上升,且VvKUP2表达趋势由上升转为下降时,与最适施肥时期相符合。  【结论】  沟施钾肥可以促进‘夏黑’果实提早着色和果实品质的提高。果实膨大后12天施钾肥在江苏盱眙和浙江金华地区促进‘夏黑’葡萄转色的效果较好,果实膨大后8天施钾肥促进浙江天台地区‘夏黑’葡萄的转色效果较好。葡萄膨大后叶片中两个钾吸收关键基因(VvKUP1和VvKUP2)表达量的变化证明了该时期施钾的必要性。