草莓LFY 同源基因的克隆及其表达分析

 以草莓（Fragaria × ananassa）品种‘花姬’为试材,通过PCR和RACE的方法克隆出LFY同源基因的cDNA全长序列,命名为FaLFY（GenBank收录号JN788260）,通过定量PCR的方法检测了该基因在草莓植株各组织和花器官中的表达。结果表明FaLFY编码区长度为1 236 bp,编码412个氨基酸,与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性,其中与蔷薇科玫瑰的LEAFY-1同源性最高,达到88%。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的组织、不同的花器官中FaLFY的表达量存在差异,其中在花芽中的表达量最高,在营养生长的组织中基本不表达,在成熟花器官中同样不表达,说明该基因在草莓的成花进程中发挥重要作用。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

草莓NBS—LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析

利用同源克隆结合RACE技术从久香草莓茎尖cDNA中分离到一个抗病相关TIR-NBS-LRR类基因FaNBS1（GenBank登录号：HQ845018）,解析了该基因及其编码蛋白的组织结构和同源特征;并采用半定量RT-PCR技术分析了该基因在不同组织中的表达差异和外源植物生长物质处理下的表达变化。该基因在基因组上长为2...     

草莓FaMDHAR和FaGR的克隆与表达分析

为了探讨草莓中单脱氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbate reductase,MDHAR）和谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GR）基因的功能,采用同源克隆的方法从‘丰香’草莓中克隆得到cDNA全长序列,并采用实时定量PCR方法对其在不同组织和不同发育阶段果实中的表达模式进行分析。结果表明：草莓MDHAR基因cDNA（FaMDHAR,GenBank登录号：KP025946）全长1 305 bp,编码434个氨基酸,分子量约为47 kD,含有保守的FAD结合结构域,定位于细胞质中。GR基因cDNA（FaGR,GenBank登录号：JQ339738）开放阅读框全长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为53 kD,定位于细胞质中。FaMDHAR在各组织中均有表达,在成熟果实中表达量最高,叶和花次之,根中最低;在果实发育过程中FaMDHAR在绿果期有相对较高的表达,随后急剧增加,到白熟期最高,之后下降并维持在相对稳定水平。FaGR在叶和花中表达较高,在成熟果实中较低;在果实发育过程中,表达量从小绿期呈现增加趋势,至转红果期达最高,随后逐渐下降,在成熟果实中较低。果实发育过程中酶活性变化呈现出与各自基因表达量相似的变化规律。经过4 ℃低温处理24 h后的草莓叶片中,FaMDHAR相对表达量较对照显著增加,而FaGR无显著变化。草莓中FaMDHAR和FaGR表达存在时空差异,并对低温逆境响应存在差异。     

苹果LEAFY同源基因的cDNA克隆与表达分析

 从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约1.4 kb的cDNA片段，分别定名为AFL1和AFL2。它们的碱基序列在编码区有90%的同源性，但在3’末端非编码区仅有约印％的同源性。它们表达的肽链氨基酸序列与小叶杨、大豆、矮牵牛等有70％以上的同源性，与番茄、金鱼草、拟南芥有近70%的同源性，证明它们是LFY的同源基因。RT-PCR的结果表明，生长期AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶芽中都有表达，而AFL1只在果台枝顶芽中表达；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养生长转向生殖生长以后才清晰表达，而AFL2在生长期6~10月都有表达。因此认为苹果中的这两个LFY同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中LFY同源基因是多拷贝的。     

扁桃AcSFB基因的克隆与原核表达分析

 利用RT-PCR和RACE技术, 从新疆栽培扁桃‘鹰嘴’花药中获得了一个全长的SFB ( S-hap-lotype-specific F-box gene) 基因(GenBank登录号为FJ362525) , 命名为AcSFBd。该基因全长1 125 bp, 编码374个氨基酸, 在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F2box基序, 含有两个高变区(Hva和Hvb)和两个可变区(V1和V2) 。生物信息学的方法成功预测了AcSFBd蛋白分子质量为43 kD, 为亲水性、非分泌型蛋白, 在基质内起连接酶(EC6. - . - . -) 的作用。成功构建了原核表达载体, 并转化大肠杆菌BL21 (DE3) , SDS2PAGE检测结果显示表达了一个约60 kD的蛋白。     

三七RNase-like 基因的克隆及表达分析

 采用同源序列克隆法,结合RACE 技术,从三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H]根茎总RNA 中克隆次生代谢相关差异表达RNase-like 贮藏蛋白的编码序列,并进一步以DNA 为模板扩增全长基因, 获得一条开放阅读框为717 bp 的cDNA 序列,命名为PMP（GenBank,KC751542),相应基因全长1 074 bp。序列及其进化分析表明,该基因包含3 个外显子和2 个内含子,编码238 个氨基酸,相应蛋白质的 分子量为27.47 kD,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2 超家族成员。三七PMP 蛋白与人参 RNase-like 贮藏蛋白高度同源,序列相似性达95%。实时荧光定量PCR 研究表明,三七PMP 基因在其根、 茎、叶、花等器官中均有表达,且3 年生根中表达量最高,暗示该基因可能参与三七皂苷次生代谢调控 及其品质形成。     

温州蜜柑线粒体基因的克隆与表达分析

 根据其它植物atp6、cob和coxⅡ基因保守区设计特异引物, 利用RT - PCR技术从‘国庆1号’温州蜜柑cDNA中分别扩增出特异性片段, 将其克隆至pBluescrip t ( sk + ) 载体上进行测序。同源性分析表明, 所克隆的atp6、cob和coxⅡ与其他植物的对应氨基酸区域同源性分别达到85%、98%和96%以上。RT - PCR分析表明它们在叶片、花瓣以及不同时期的花蕾中都有表达, 在幼果中没有表达。Southern分析表明它们在温州蜜柑基因组DNA中为多拷贝。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

森林草莓独脚金内酯合成关键基因D27的克隆与表达分析

根据森林草莓中独角金内酯合成过程中的关键基因D27的序列信息设计引物,获得了D27基因的完整开放阅读框架。采用MEGA5.0软件,对森林草莓与其他物种D27基因编码的氨基酸序列进行聚类分析,发现森林草莓D27基因与其他物种D27基因具有较高的同源性。设置正常供磷、缺磷和在缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌处理,利用电感耦合等离子发射光谱仪测定草莓植株的磷含量,结果表明缺磷条件下接种丛枝状菌根真菌,草莓植株中磷含量极显著提高,而缺磷处理的磷含量极显著降低。实时荧光定量PCR结果表明,与正常供磷处理相比,缺磷和接种丛枝状菌根真菌处理条件下,D27基因的表达量分别上调7倍和11倍,这说明D27基因的表达既受到磷水平调控,又受到菌根形成的调控。     

草莓9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2228bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

黄瓜ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA的克隆及表达

 利用cDNA末端快速扩增技术, 从黄瓜叶片组织中获得脂肪酸去饱和酶基因（Cs-FAD）,其序列长度为1 807 bp,编码445个氨基酸,推导的氨基酸序列与已经报道的ω-3脂肪酸去饱和酶基因序列同源性较高,与桃果实的同源性最高（77%）。利用RT-PCR半定量分析显示,该基因在绿色组织如茎、叶、卷须里表达量较高,在根、花、果实及种子里也有少量表达。     

砧木南瓜硅转运蛋白基因CmLsi3的克隆与表达分析

以用于黄瓜嫁接的砧木南瓜‘云南黑籽南瓜’（Cucurbita ficifolia,去蜡粉能力弱）和‘黄诚根2号’（C. moschata,去蜡粉能力强）为试材,采用同源克隆与RACE相结合的方法克隆到硅转运蛋白基因cDNA全长,命名为CmLsi3（GenBank登录号分别为KM203110和KM359142）。两种砧木南瓜CmLsi3基因cDNA全长为1 206 bp,开放阅读框为795 bp,编码264个氨基酸,两者仅有4个位点的氨基酸不同,但与黄瓜、玉米、大麦等作物硅转运蛋白氨基酸序列同源性均在50%以上。CmLsi3蛋白含有2个NPA模体、6个跨膜结构域以及1个由Gly（G）、Ser（S）、Gly（G）和Arg（R）组成的ar/R选择性过滤器,属于水通道蛋白NIPⅢ亚家族。实时荧光定量分析表明,CmLsi3基因在砧木南瓜根、茎、叶中均有表达,且‘云南黑籽南瓜’各器官CmLsi3基因的表达水平高于‘黄诚根2号’。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1 的克隆及原核#br# 表达

 根据已经获得的鱼腥草UGT75C1 转录本序列设计1 对引物,采用RT-PCR 方法获得UGT75C1 基因cDNA 序列,并对UGT75C1 蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR 方法检测了UGT75C1 基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1 基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1 上,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,通过IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 检测表达产物。克隆获得的UGT75C1 基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp, 编码486 个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1 蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。 UGT75C1 在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核 表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

白菜叶形发育相关基因BrLOM2的克隆与表达分析

为了揭示白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)BrLOM2基因在叶发育中的调控机制,以白菜圆叶、裂叶近等基因系为材料,同源克隆得到BrLOM2基因,分析其时空表达特性及对激素的响应。结果显示,BrLOM2的ORF全长为549 bp,编码182个氨基酸,含有GRAS家族保守结构域,定位于细胞核,两种材料中的氨基酸序列在保守结构域存在两处突变。进化分析表明,BrLOM2属于十字花科LOM2分支,与大白菜(XP_009138823.1)亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,BrLOM2在圆叶白菜中的表达量高于同期裂叶白菜,两种材料茎尖、第1片叶中表达量最高;裂叶中的表达量与叶缘裂刻数呈现同步增加的趋势,6-BA和GA_3分别抑制和促进叶片中的表达,说明BrLOM2低表达可能是裂叶表型产生的主要原因。     

芋淀粉分支酶SBE基因的克隆与表达分析

以多子芋品种‘香堂芋’幼嫩叶片为试材,利用RACE结合RT-PCR技术克隆得到全长为3 051 bp的淀粉分支酶SBE基因cDNA序列（登录号：KX013544）,其中开放阅读框长2 538 bp,编码845个氨基酸;该序列与玉米SBEII、马铃薯SBEIIa同源性均达85%以上;芋SBE编码蛋白具有N–末端、C–末端和α–淀粉酶催化域。利用RT-PCR技术克隆得到芋SBE的基因组DNA序列,全长为12 362 bp,包括20个外显子和19个内含子。芋球茎形成过程中,子芋植株叶片中SBE表达量显著高于母芋植株叶片、叶柄和根系及母芋等组织,子芋膨大过程中SBE表达量逐渐升高,而孙芋膨大过程中SBE表达量逐渐下降。子芋、孙芋SBE表达对支链淀粉合成积累可能起重要作用。