双价抗虫节水抗旱稻新材料旱恢3CA的创制

绿色超级稻的育种目标是少打农药、少施化肥、节水抗旱和优质高产。为培育“少打农药,节水抗旱”的资源节约型、环境友好型水稻品种,本研究以T1C-19、T2A-1作为cry1C^*和cry2A的基因供体,与节水抗旱稻恢复系旱恢3号品种杂交,利用分子标记辅助选择技术对目标基因进行筛选,最终获得同时含有cry1C^*和cry2A基因的稳定株系。通过PCR以及对Cry1C^*和Cry2A蛋白的定性和定量检测,结合正常管理田间农艺性状考察及不防治螟虫田间管理的抗虫性鉴定,筛选出双价抗虫节水抗旱稻新恢复系旱恢3CA。结果显示,对照旱恢3号与旱恢3CA在农艺性状上无显著差异,但早恢3CA高抗稻纵卷叶螟。本研究结果为培育既节水抗旱又抗虫的水稻新品种奠定了材料基础。     

浅析湘西州发展节水抗旱稻的意义及策略

随着水资源的匮乏及干旱问题的频发,节水抗旱稻的选育与推广越来越受到关注。湘西州有关节水抗旱稻的引种及栽培技术研究尚未有报道,因此阐述了发展节水抗旱稻的意义,介绍了湘西州节水抗旱稻的种植现状,提出了湘西州发展节水抗旱稻的策略,以期为湘西州节水抗旱稻的发展提供参考。     

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的影响

转Bt基因抗虫水稻的成功研发,为有效控制鳞翅目害虫对水稻的危害提供了一条最为有效、经济的途径。稻田底栖动物群落是转Bt基因抗虫水稻的重要非靶标生物。为了解转Bt基因水稻对稻田底栖动物群落的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻‘华恢1号’(简写为HH1)为材料,以其非转基因亲本‘明恢63’(简写为MH63)为对照,以稻田底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法,通过连续2年在江西南昌的大田试验,研究了转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示:2012年在HH1与MH63的稻田中分别采集到底栖动物22种与25种,其中两生境中相同物种19种,两群落物种组成相似度为0.808 5,有7种优势种,优势种相似度为0.833 3。2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物26种与28种,两类稻田相同底栖动物22种,两群落物种组成相似度为0.814 8,有6种优势种,优势种相似度为1.000 0。2012年与2013年群落总体分析与时间动态分析均显示,两类稻田中底栖动物的物种丰富度、个体数量、多样性指数、均匀性指数及优势集中性指数变化趋势相似,且均无显著差异。结果表明:连续种植2年转Cry1Ab/Ac基因水稻HH1对南昌稻田底栖动物群落无明显的负作用。     

用合成多肽为半抗原制备Bt Cry1Ab的单克隆抗体

由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。     

双价苏云金芽孢杆菌cry基因载体构建及其在大肠杆菌中表达杀虫活性

研究和利用不同苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫蛋白之间的增效作用是构建高效遗传工程虫剂，预防和延缓害虫抗性的重要途径。BtCry1Ab,Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对重要的鳞翅目农业害虫具有主毒力，质粒pHT-BSK含有能在大肠杆菌（Echerichia coli)－枯草芽孢杆菌（B.subtilis)有效表达的生物安全性标记基因卡那霉素抗性基因。将含Btcry1A,cry1Ac和cry2Aa全长基因的Bam HI/PstI,Bam H I/Xho I和Sma I(Bam H I)HindⅢDNA片段与pHT-BSK的应酶切产物连接，获得了单价cry/km^r组合的重组质粒pBlue-1Ab-km^r,pBlue-1Ab和pHT-2Aa;cry1Ab,cry1Ac DNA片段与pHT-2Aa相应酶切产物相连接获得了Bt双价基因／km^r组合重组质粒pBlue-crylAb-km^r-2Aa和pBlue-cry1Ac-km^4-2Aa，重组质粒中所有cry基因与km^r均形成特异的Bam H I片段。限制酶切电泳分析和特异PCR扩增证实了重组质粒的准确连接。含有重组质粒的大肠杆菌显示了对小菜蛾（Plutella xylostella）和玉米暝（Ostrinia furnacalis)的杀虫活性，对小菜蛾双价基因毒力高于单价基因，但对玉米螟它们之间没有明显差异。研究为进一步阐明Bt cry 2Aa与cry1Ab和cry 1Ac之间在不同微生物细胞中的共表达及其表达产物之间的相互作用和构建双价基因杀虫工程菌株创造了条件。     

抗除草剂基因导入旱稻（Oryza sativa）栽培品种

摘要：以生产上优良旱稻（Oryza sativa L. ）新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料，用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织，经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株，对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测，T0和T1代Basta抗性实验表明，bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中，并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明，MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基，改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统，为旱稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。     

泥鳅生长及抗氧化 解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。     

转基因水稻Bt汕优63的整合结构和品系特异性定量PCR方法

为更好地监测转基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)Bt汕优63品系的存在,满足转基因标识管理的要求,同时也为了解决阳性植物基因组DNA不容易获得的问题,本研究采用热不对称交互PCR(TAIL-PCR)、Genome Walking和长链PCR(LD-PCR)方法测定了基因枪转化的转cry1Ab/cry1Ac融合基因水稻品系Bt汕优63的外源插入DNA全序列,构建了含有Bt汕优63 3′旁侧和水稻内标基因gos9序列的标准质粒分子pMDBt63作为标准物质,建立了Bt汕优63实时荧光定量PCR方法.外源插入DNA全长9 818bp,位于水稻基因组10号染色体(AP008214)第5348630位,由8个来源于两个转化质粒的DNA片段组成,其中两个cry1Ab/cry1Ac表达框以正向串连的方式插入.gos9和3′旁侧两个定量标准曲线的相关系数(R2)分别为0.9997和0.9992,扩增效率(E)分别为98.05%和99.46%.每反应100 ng模板DNA的检测限(LOD)为10拷贝,定量限(LOQ)为100拷贝.此外,对已知5%和1%转基因含量的混合样品DNA进行定量检测,结果的平均值分别为4.98%和1.07%.结果表明标准质粒pMDBt63作为标准物质建立的定量方法可用于Bt汕优63的定量检测.     

抗除草剂基因导入早稻（Oryza sativa）栽培品种

以生产上优良旱稻(Oryza sativa L．)新品种旱稻297、旱稻10号等的幼胚愈伤组织为转化受体材料,用基因枪法把抗Basta除草剂的bar基因导入了这些品种的愈伤组织,经两轮Basta抗性筛选和分化获得了再生植株,对再生植株进行PCR扩增和Southern杂交检测,T0和T1代Basta抗性实验表明,bar基因已整合到旱稻的基因组DNA中,并在T1代继续表达。对各品种幼胚培养的诱导、分化培养基实验表明,MB和MS培养基可作为这5个品种的愈伤组织诱导培养基,改良的RMB2、RMS2培养基可显著地提高愈伤组织的分化频率。实验所获得的转基因植株和建立的遗传转化系统。为早稻的抗除草剂分子育种和其它基因转化奠定了初步的基础。     

旱稻“旱优73”三系制种技术初探

旱优73是籼型三系节水抗旱稻新组合,具有节水抗旱、抗性强、米质优、适应性广等特点。亲本主要有旱恢3号以及沪旱74,前者通常在5月上旬播种,后者通常在6月初播种,因此必须要做好相应的防雨工作。基于此,介绍了旱优73在大丰区制种父母本的生育特性,并总结出该组合在大丰区的高产制种技术,希望能够为相关人员提供借鉴。     

Cry1Ab转基因水稻的杂种优势表现及抗虫性鉴定

以携带Cry1Ab基因的"克螟稻"为抗虫供体亲本,将目标基因转导到优良恢复系"R6547"、"R818"中,配制的杂交稻组合表现良好的杂种优势水平,克服了"克螟稻"在常规粳稻育种实践中常出现的农艺性状差、前期生长势弱的缺陷。可溶性蛋白含量检测结果显示目标基因在杂交稻中仍能高水平的表达,并在人工接虫和自然发生条件下对稻纵卷叶螟、二化螟等鳞翅目害虫表现优良抗性。     

Characterization of the transgenic rice event TT51-1 and construction of a reference plasmid

Transgenic rice TT51-1 (BT63) is an insect resistant strain that was granted for safety certificate in China in 2009. This study characterizes the transgenic event TT51-1 using a GenomeWalker strategy. The organization of the transgenes indicated that the transgenes on two plasmids, pFHBT1 and pGL2RC7, had been integrated at the same locus. The sequence of the event TT51-1 spanned 8725 bp, including a truncated Cry1Ab/Ac cassette, an intact Cry1Ab/Ac cassette, two Amp gene segments, and an Hph gene segment. The 5' and 3' plant flanking sequences were isolated and used to locate the transgenes to chromosome 10 in TT51-1. The isolated TT51-1 fragment and a fragment of the rice PLD gene were integrated into a plasmid vector, to create plasmid pK-TT51 as a calibrator for detecting rice containing TT51-1. Analysis of unknown samples indicated that the reference plasmid was a reliable alternative to TT51-1 genomic DNA.     

辐射诱变选育特优63糯的研究

用60 Coγ射线 35 0Gy分别照射杂交稻保持系 (B系 )和恢复系 (R系 )干种子 ,M2 获得相应的糯性基因wx突变体 ,并育成糯不育系wxA和糯恢复系wxR ,组配出杂交糯稻新组合。特优 63糯与特优 63具有相似的生育期、农艺性状、产量水平和抗性。     

转拟南芥NPR1基因桂99 T3代植株的抗病性及农艺性状表现

以转拟南芥AtNPR1基因的恢复系品种桂99T3代纯合株系为材料,考查其农艺性状及其抗病性,并比较转基因植株与桂99侵染水稻白叶枯病菌后的农艺性状。结果表明：转基因植株表现出对水稻白叶枯病的抗性显著增强77%以上;穗长、剑叶长、有效穗数、一次枝梗数、每穗实粒数、单株产量和谷粒宽等农艺性状与未转基因桂99无显著差别。在受到水稻白叶枯病菌侵染后,转基因植株的一次枝梗数、每穗粒数、每穗实粒数和单株产量等方面均比对照桂99高出13%～78%。说明AtNPR1基因增强了水稻的抗病能力,从而降低了病害引起的产量损失。转基因植株的恢复力不受影响,稻米品质比桂99更加优良。本工作为转基因水稻抗病育种的研究奠定了基础。     

Cry1Ac蛋白降解菌株FJSB3的分离鉴定及降解特性

从转Cry1Ac基因水稻种植田土壤中,分离纯化得到1株能高效降解Cry1Ac蛋白的细菌FJSB3。通过表型特征、16S rDNA扩增和电镜观察,初步鉴定FJSB3为寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。FJSB3发酵液能降解粗Bt蛋白。通过单因素试验确定FJSB3降解水稻秸秆中Cry1Ac蛋白的最适条...     

利用分子标记辅助选择Pigm-1基因改良恢复系R20的稻瘟病抗性

水稻稻瘟病是水稻的重要病害之一,给我国甚至全世界的水稻安全生产带来了巨大隐患.选育优质抗稻瘟病恢复系,进而培育稻瘟病水稻杂交组合,是选育抗稻温病品种的有效途径之一.本研究以双抗77009为抗性基因Pigm-1的供体亲本,以感病恢复系R20为受体亲本,通过杂交和连续回交方法,并利用分子标记辅助选择技术,定向改良优质水稻恢...     

辐射诱变育成系列糯稻的主要生物学特性

研究了经辐射诱变育成的糯稻不育系、保持系、恢复系和杂交糯稻的主要生物学特性,分析了杂交糯稻的稻米品质。结果表明,糯稻具有与原品种相同的生育期,相似的农艺性状、穗部和花器性状。糯不育系具有与原不育系相同的花粉不育特性。杂交糯稻保留了原杂交稻的产量水平和产量潜力,此外杂交糯稻具有与常规糯稻鄂荆糯6号相似的稻米品质。     

Indicated detection of two unapproved transgenic rice lines contaminating vermicelli products

We analyzed the DNA fragments extracted from four rice vermicelli products. The Bacillus thuringiensis (Bt) rice line, which has a construct similar to the GM Shanyou 63 line, was detected in some vermicelli products by identification of the junction region sequence between rice Act1 promoter and the Cry1Ac gene, and that between Cry1Ac and nos. In addition, we also detected a different Bt rice line by means of the junction region sequence between the maize ubiquitin promoter and cry1Ab gene and that between the cauliflower mosaic virus 35S promoter and the hygromycin phosphotransferase in some vermicelli products. Accordingly, we for the first time have detected the two transgenic Bt rice lines contaminating rice vermicelli samples. Furthermore, we developed a duplex real-time polymerase chain reaction (PCR) method for the simultaneous detection of both Bt rice lines.     

Rapid digestion of Cry34Ab1 and Cry35Ab1 in simulated gastric fluid

Two genes were identified in Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) that code for the proteins that comprise a Cry34Ab1/Cry35Ab1 binary insecticidal crystal protein. Maize, Zea mays L., plants have been transformed to express the Cry34Ab1/Cry35Ab1 proteins, and as a result, these plants are resistant to attack by western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte, a major pest in the Midwestern corn-growing area of the U.S.A. As part of the safety assessment for the proteins, digestibility studies were conducted. Digestion experiments with both proteins demonstrated rapid degradation in simulated gastric fluid, comparable to other registered plant-incorporated protectants. Quantitative and qualitative approaches for determining digestibility are illustrated.