机理I植物铁吸收与运输的分子机制

铁虽然在地壳中的含量很高，但生物有效性非常低，植物如何适应缺铁胁迫一直是植物营养与植物逆境生理领域研究的热点问题。近两年来，人们对于植物，尤其是机理I植物适应铁胁迫的机制又有了新的认识：铁还原酶基因的表达部位除根系外，在地上部、花等器官也能够检测到；IRT1基因是机理I植物主要的Fe (Ⅱ) 运输基因；烟碱酰胺在铁的长距离运输中起到重要作用。本文从还原、吸收、长距离运输及对这些过程的调控等方面综述了近年来有关机理I植物适应铁胁迫的研究进展，并对将来的研究方向进行了初步展望。     

基于BSA-seq的拟南芥辐射诱变突变体的基因定位

辐射诱变极易导致染色体结构变异，目前鲜有采用BSA-seq方法定位辐射诱变突变体基因的研究报道。为探索BSA-seq用于辐射诱变突变体的基因定位的可行性，本研究通过辐射诱变筛选得到一个拟南芥突变体，将其与亲本杂交，在F2代分离群体中根据表型筛选单株，构建两个极端表型的子代混池；将两个子代混池与亲本混池进行全基因组测序，使用MutMap、QTL-seq和GPS等多种BSA-seq定位策略对其进行定位分析。结果表明，多种BSA-seq定位策略均取得了一致的结果，在2号染色体上获得7 Mb的初步定位区间；使用IGV软件对该区间内的基因组进行可视化，发现该区间内存在25 189 bp的大片段缺失，缺失区段包含6个基因；通过SnpEff进行突变位点注释，经基因注释信息推测AT2G28610为候选基因；通过遗传学试验验证了该候选基因为突变基因。本研究结果为应用BSA-seq技术定位辐射诱变得到的突变位点提供了参考。     

人的β干扰素基因在烟草中整合及表达

本研究把含有β干扰素基因的植物表达载体ｐＧ２１（含有β干扰素基因的信号肽）和ｐＧ１１通过三亲结合转移到了农杆菌Ｃ５８Ｃ１（ｐＧＶ２２６０）中，并与ｐＧＶ２２０６０发生同源重组而稳定存在于它Ｔｉ质粒ｐＧＶ２２６０上，进一步用此载体把β干扰素工因转移到了烟草细胞中Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析证明了此基因已整合到染色体上，ＲＮＡ点杂交及ＮＰＴⅡ酶分析显示此基因植物细胞中得到了表达，实验中还发现含有ｐＧ２１的农杆     

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。     

谷子脂转移蛋白cDNA的克隆及特性研究

摘要：首次报道了从谷子(Stetaria italica )未成熟种子cDNA文库中克隆到1个与其它物种脂转移蛋白（LTP）具有较高同源性的脂转移蛋白基因Siltp。将核苷酸序列和推断的氨基酸序列在GenBank中进行比较，发现Siltp与大麦脂转移蛋白LTP7a2b和LTPcw-19,玉米脂转移蛋白，欧洲油菜的脂转移蛋白基因的核苷酸序列的同源性分别为72%,70%,60%,54%；氨基酸序列的同源性分别为79%,73%，65%，57%。序列分析表明，编码区含363个碱基 ，编码121个氨基酸，其中包括26个氨基酸的信号肽序列，分子量为9.3 kD。基因组Southern杂交结果表明，Siltp在基因组中以单拷贝存在。Northern杂交研究Siltp的时空表达特异性，发现Siltp仅在茎、叶、穗中表达。利用软件PAUP对17种植物的LTP进行进化分析，从进化系统树可以看出LTP有4个分支，其中，小麦发生分化较早，其它几种单子叶植物如玉米、谷子、大麦和水稻分化较晚，说明发生了早期的基因复制事件。在整个系统图中，双子叶比较分散，说明LTP基因的进化是个复杂的过程；禾本科作物的脂转移蛋白基因是由一个原始基因分化而产生的不同分支，Siltp与大麦LTP亲缘关系最近。     

WRKY转录因子调控植物养分吸收利用及重金属解毒的研究进展

WRKY蛋白是植物特有的一类重要转录调控因子，它们通过与下游基因启动子上的W-box元件特异性结合诱导或抑制相关基因的表达，从而调控植物生长发育以及植物对生物和非生物胁迫的响应。植物WRKY基因组数目多，在拟南芥、大豆和水稻基因组中已经分别鉴定出74、182和109个，在植物对干旱、盐害、高温、养分匮乏和病原体感染等各种生物、非生物胁迫的响应过程中起关键作用。例如AtWRKY45和AtWRKY75参与调控拟南芥应答低磷养分胁迫，GmWRKY142正向调控拟南芥对镉胁迫的耐受性。在植物面对逆境胁迫时，WRKY蛋白通过与养分相关基因启动子的W-box元件特异性结合，进而实现自我调节或交叉调节，激活或抑制下游基因的转录以应对各种逆境胁迫。众多WRKY下游靶基因也已被鉴定出来，例如PHT家族成员与磷营养相关；3个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因参与调控植物对氮素的吸收利用；6个拟南芥WRKY基因、10个大豆WRKY基因和5个水稻WRKY基因调节植物应对低磷胁迫；2个拟南芥WRKY基因和6个大豆WRKY基因影响植物对钾的吸收利用；3个大豆WRKY基因参与调控植物对硫营养的吸收利用；1个拟...     

天祝白牦牛SRY基因克隆与原核表达

从天祝白牦牛的基因组DNA中扩增了SRY（Sex-determining Region on the Y Chromosome，SRY）基因编码区序列，将其克隆至pGEM-T easy载体并送至生物公司测序，天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp，编码229个氨基酸；对牦牛和奶牛的SRY基因编码区进行序列比对，发现存在2个碱基的变异，造成1个氨基酸的变异；将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体，成功构建了表达载体pET-28a/SRY；把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，在合适的条件下诱导该大肠杆菌，SRY蛋白得到了大量表达；对表达产物进行了Western-blot检测，进一步确定牦牛SRY蛋白得到表达。     

柑橘线粒体基因的表达研究初报

线粒体基因组作为植物细胞内的三套遗传系统之一，在细胞的生命活动中扮演着重要的角色，如呼吸、能量生成、碳骨架的供应等（Mackenzie et al．，1994）。此外，在雄配子的发育中线粒体基因也起着关键的作用（Schnable and Wise．1998）。尽管地钱和拟南芥的线粒体基因组序列测序已相继完成，但对于线粒体基因组如何转录还所知甚少。     

芪合酶基因转化小白菜的研究*

利用质粒pBin438构建了含有NPT Ⅱ基因和葡萄芪合酶(RS)基因的芪合酶组成型植物表达载体EHA105/pBinRS。用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将RS基因导入纯合系小白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)品种中，经Kan抗性筛选、PCR及RT-PCR检测，RS基因已整合到小白菜基因组中并得到了表达，共获得了7株转基因植株。     

花药培养获得转Bt基因抗虫水稻纯系*

采用改良一步成苗法，对转Bt基因水稻(Qryza sativa L.)“克螟稻”与粳稻(O.sativa ssp.japonica)品种秀水63的杂种F1进行花药培养，结果表明：Bt基因不影响花培绿苗分化，但改变绿苗分化进程。对“克螟稻”与秀水63的杂种花培株观察表明，Bt基因按孟德尔规律简单遗传。携带Bt基因与否直接影响花培苗的成活率；潮霉素筛选可增加Bt转基因阳性株的相对比率，但显著降低绿苗率；花培产生的带Bt基因株系与不带Bt基因株系间的农艺性状差异不显著。经培养，成功选育3个抗虫和高产的转基因新品系。     

串联抑制素基因克隆与重组质粒的构建

根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。     

拟南芥AtHOS10基因的克隆及其表达载体的构建

AtHOS10基因对植物冷调节起到重要作用,可以通过控制ABA合成来改变植物的脱水胁迫耐性。本文利用PCR方法从Columbia生态型的拟南芥基因组中扩增出冷调节基因AtHOS10,并插入克隆载体。序列分析表明,克隆片段长3453bp,与目前发表的序列完全一致。将pUC-AtHOS10和pBI-HEM进行酶切重组构建表达载体pBI-AtHOS10,然后将表达载体转化导入农杆菌中,为侵染烟草作准备。     

Tth DNA聚合酶基因的分段PCR克隆及其表达载体构建

利用计算机软件对取自ＧｅｎＢａｎｋ的嗜热栖热菌ＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＨＢ－８的ＤＮＡ聚合酶基因（Ｔｔｈ）进行分析,并设计了两组引物进行ＰＣＲ,分段克隆该基因。将两个ＰＣＲ产物同时连接到另一个克隆载体上,使之成为完整基因,最后将完整基因克隆到表达载体上,构建了Ｔｔｈ基因的表达质粒,使之适合在以大肠杆菌为寄主的细胞中进行表达。     

一种改良的从LongSAGE标签中鉴定猪新基因的GLGI方法

将长的基因表达序列标签(LongSAGE)和结合标签的基因序列延伸(GLGI)技术相结合,对GLGI的方法进行改良。(1)将原始GLGI方法中正向引物中长为10bp的SAGE标签特异序列改为17bp的LongSAGE标签;(2)针对不同LongSAGE标签,在PCR反应中给定相应不同的退火温度;(3)在PCR反应中用普通的DNA聚合酶代替高保真酶(Pfu);(4)在PCR反应的克隆中,使用普通的T载体和感受态细胞代替原始方法中特异的载体和感受态细胞。利用改良的GLGI方法分离的EST位于cDNA的3′末端并带有加尾信号和ploy(dA)尾巴。该方法在鉴定低丰度表达的基因时比普通的EST测序方法具有更高的灵敏性。     

抗青枯病转群体感应猝灭基因烟草的培育

利用具有猝灭青枯菌群体感应信号分子功能的aac基因构建高效植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株57株。经PCR及RT-PCR检测,筛选得到30株阳性转基因再生苗,并证实了目的基因已经整合到烟草基因组中,且在转录水平上得到表达。转基因植株苗期抗青枯病试验表明,16天后转基因烟草较对照植株病情指数降低了51,相对病情指数为56.5％。     

TMV和PVY外壳蛋白双基因融合干涉及烟草转化

为了降低烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）和马铃薯Y病毒（potato irus Y,PVY）复合侵染对烟草带来的危害,本实验找到TMV—CP和PVY—CP基因部分保守序列,将保守序列进行双基因融合,此双基因即为RNAi的靶序列,用限制性内切酶将双基因从pMD18-T载体上切下,正反向连接到pUCCRNAi载体后,经酶切鉴定后定向连接到含超强启动子的pC2300—35S—OCS表达载体上,利用冻融法将此表达载体导入只含辅助质粒的根癌农杆菌中,构建含靶序列反向重复结构的RNAi双元载体系统,提取转化质粒,经酶切验证鉴定表明TMV和PVY外壳蛋白基因植物表达双元载体构建成功。并转化烟草,获得了3株对TMV和PVY抗性显著提高的转基因烟草。     

藏绵羊MHC-DRB1基因第3外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

为了研究藏绵羊DRB1基因第3外显子多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、变异类型和各等位基因间的遗传关系,本研究采用PCR-SSCP方法,分析了500只藏绵羊(Ovis aries)DRB1基因第3外显子多态性,并对不同等位基因进行克隆和测序。结果表明,藏绵羊DRB1基因第3外显子表现了8个等位基因,8个单倍型序列分析发现了15个核苷酸多态位点,与GenBank序列对比分析,有7个DRB1的等位基因是首次发现。8个DRB1第3外显子的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。3个种群藏绵羊中B均为优势等位基因,该位点PIC>0.5,为高度多态且显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。研究认为,藏绵羊DRB1基因第3外显子具有丰富的多态性;藏绵羊DRB1基因最初是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。     

番茄LeNCED1基因5′-侧翼序列克隆及LeNCED1p:GUS融合基因构建

从番茄基因组中克隆LeNCED1基因5′-侧翼1456 bp调控序列,经生物信息学分析表明,LeNCED1基因上游调控序列中存在响应昼夜节律的顺式作用元件Circadian、光响应元件Box I、逆境胁迫响应元件(TC-rich repeats)、ABA响应元件ABRE等,构建了LeNCED1基因上游调控序列与报告基因GUS融合的植物双元表达载体pLeNCED1p:GUS。     

可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体构建

为了剔除冗余且有潜在安全问题的选择标记基因,本研究通过PCR扩增出ubiquitin启动子序列、lox P序列、Cre-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因的编码区序列,采用酶切连接的方法将其引入载体p BRACT806,从而构建一个新的可诱导剔除选择标记基因及重组酶基因的表达载体p BLCK,测序结果显示其构建成功。该载体含有Gateway组件,可进行外源目标基因的高效重组整合;具有NPTⅡ基因,利于转基因植株的筛选;具有可诱导剔除外源基因的Cre-GR组件,诱导处于lox P位点之间的抗性标记基因NPTⅡ和Cre-GR融合基因的剔除,保留目标基因表达元件。此外,目标基因、Cre-GR融合基因和NPTⅡ基因都由ubiquitin强启动子控制,可在农作物中组成型超量表达外源基因。本研究为农作物转基因安全性研究提供了新的载体系统,具有一定的育种价值。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。