宜宾市冬春季禽流感监测结果分析

为及时掌握全市高致病性禽流感病毒在家禽中的感染、带毒和流行情况,宜宾市通过对养殖场、活禽交易市场、家禽屠宰场等场点的鸡、水禽、人工饲养的鸽子等采样进行禽流感病原学监测和血清抗体监测。结果发现：212份病原学样品中,禽流感阳性13份,阳性率6.1%;全市450份血清样品,H5抗体阳性387份,阳性率86%。结果分析：禽流感病原学阳性主要集中在7个活禽交易市场和3个禽类屠宰场,证明禽流感病毒在活禽交易市场和禽类屠宰场广泛存在,具有感染禽流感的风险;抗体阳性主要为规模养殖场,证明规模养殖场免疫效果较好,抗体水平高。     

蛋鸡禽流感和新城疫免疫抗体带毒状况评估

禽流感和新城疫是严重危害养禽业的重要病毒性疫病,为掌握上海地区蛋鸡场禽流感和新城疫免疫效果及病毒感染状况,于2016年每隔2月对上海市2家规模蛋鸡场的193份血清样品、720份棉拭样品进行了血清学和病原学检测。结果表明,2家规模蛋鸡场禽流感和新城疫的免疫抗体良好,除检出1份H9亚型禽流感病毒阳性外,其他病原学检测结果均为阴性,表明上海市蛋鸡场在生物安全管理、免疫程序实施、防控措施布置等方面均比较到位,有效降低了疫病发生风险。     

某粉壳蛋鸡场禽流感、新城疫免疫抗体检测及禽流感H7亚型病原学调查

禽流感和新城疫是严重危害养禽业发展的疫病,为了解平阳地区某粉壳蛋鸡养殖场禽流感和新城疫免疫效果及禽流感H7亚型病毒感染状况,于2018—2020年每3个月对该规模蛋鸡场进行采样,共采集10个批次的血清样品和鸡喉肛棉拭子样品各329份,并进行血清学和病原学检测。结果显示:禽流感H5亚型10个批次免疫抗体合格率在83%以上,禽流感H7亚型9个批次免疫抗体合格率在83%以上,仅1个批次的合格率低于70%,新城疫10个批次免疫抗体合格率在94%以上;禽流感H7亚型病原学检测结果均为阴性。说明该养殖场禽流感和新城疫的免疫效果良好,无禽流感H7亚型病毒感染的情况。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

毕节市优质肉鸡禽流感监测及防控措施

为了解贵州省毕节市优质肉鸡的禽流感流行情况,采取抽样检测的方式,采集鸡血清样品340份和鸡咽泄拭子样品475份,分别进行禽流感免疫抗体和病原学检测。结果显示,340份血清样品禽流感H7亚型免疫抗体合格率100%, H5亚型免疫抗体合格率99.71%; 475份鸡咽泄拭子禽流感H7和H5病原学检测均为病毒核酸阴性。该研究通过对肉鸡进行禽流感监测,及时做好预警预报分析,发挥动物疫病防控的积极作用。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

广西猪流感血清学调查

采用血凝抑制试验对广西7个市30个猪场的2156份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3亚型抗体的检测。结果显示,在被调查的30个猪场中,H1亚型抗体阳性率为96.67%,H3亚型抗体阳性率为86.67%,H1 H3亚型抗体阳性率为86.67%;在检测的2156份血清样品中,H1亚型抗体阳性率为29.04%,H3亚型抗体阳性率为31.54%,H1 H3亚型抗体阳性率为12.15%。表明在所调查的广西猪场中,猪流感病毒的感染较为普遍,大部分猪场都曾被H1、H3亚型感染。     

检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9亚型禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA(NP-ELISA)方法。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为7.56μg/ml,血清最适稀释度为1∶160,作用时间为60 min;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG最适稀释度为1∶5 000,血清和酶标抗体最适作用时间为60 min。特异性试验结果表明,NP抗原可与H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体发生反应,经NP-ELISA检测为阳性的H9亚型AI血清样品能够被H9亚型AIV阻断,而NP抗原与新城疫等4种疫病阳性血清不发生反应。对223份待检鸡血清进行检测,NP-ELISA阳性检出率为96.86%(216/223),而血凝抑制试验、琼脂免疫扩散试验结果分别为93.72%(209/223)和81.61%(182/223),表明NP-ELISA是检测禽流感型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

重组禽流感(H_5+H_7)二价灭活苗免疫抗体监测与分析

为了解使用重组禽流感病毒(H_5+H_7)二价灭活苗的免疫效果, 2018年春秋防结束后凌云县分别对规模家禽养殖场或养禽大户(以下简称养禽场)和农村散养家禽户随机抽取家禽免疫血清样品,进行禽流感H_5、 H_7亚型免疫抗体监测。检测结果显示,禽流感H_5亚型和H_7亚型抗体总体合格率分别为83.27%、 87.97%, H_7亚型免疫效果优于H_5亚型;养禽场和农村散养户禽流感H_5、 H_7亚型抗体合格率分别为81.36%、 85.42%和85.42%、 90.79%,养禽场的抗体合格率比散养户略低。鸡禽流感H_5、 H_7亚型抗体合格率分别为85.45%、 90.79%,水禽禽流感H_5、 H_7亚型抗体合格率分别为79.38%、 83.2%,鸡的禽流感H_5、 H_7亚型抗体合格率比水禽高。一次免疫禽流感H_5亚型和H_7亚型抗体合格率分别为80.16%、 85.63%,二次强化免疫H_5亚型和H_7亚型抗体合格率分别为87.83%、 91.39%,通过二次强化免疫,大幅度提高免疫抗体水平,极大降低了疫情发生风险。     

靖西大麻鸭主要疫病的监测及防控效果评估

为掌握靖西大麻鸭A型流感、鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌等主要疫病流行情况及H5亚型禽流感免疫效果,2015~2016年共对采自于活鸭、病死鸭、外环境样品495份使用RT-PCR进行A型流感病原核酸检测,结果检出阳性样品13份,阳性率为2.63%;对85只不同日龄阶段死亡的靖西大麻鸭进行病原检测,检测鸭瘟全部呈阴性,病毒性肝炎呈阳性3份,阳性率为3.5%,鸭疫里默氏杆菌呈阳性6份,经血清型鉴定均为血清I型,阳性率为7.1%;检测靖西大麻鸭血清样品1313份,H5亚型禽流感免疫抗体合格1112份,合格率为84.1%。同比2014年,2015~2016年靖西大麻鸭A型流感病原阳性率(下降8.05个百分点)显著下降(P=0.04290.05),鸭疫里默氏杆菌检出率下降10.3个百分点,鸭H5亚型禽流感免疫抗体合格率提高5.9个百分点。表明靖西大麻鸭A型流感、鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌等主要疫病防控工作逐年得到加强,效果显著,但依然存在疫情风险。     

鸭源禽流感病毒的分离与鉴定

用灭菌棉拭共采集蛋鸭和肉鸭的泄殖腔样品 62只 ,鸡胚尿囊腔传代接种法分离到 1株病毒 ,该病毒可凝集鸡红细胞 ,且不能被 ND、EDS-76阳性血清抑制 ,用病变绒毛尿囊膜制备抗原与禽流感琼扩标准阳性血清作用 ,出现明显的白色沉淀线 ,证明该分离株为 A型流感病毒 ,血凝素亚型分析结果为 H9,电镜负染观察可见典型的禽流感病毒粒子 ,致病性试验结果表明该分离株对鸡表现为弱致病性。研究结果还表明 ,环境 (特别是水体 )贮毒可能是禽流感病毒得以长期存在和传播的重要因素和媒介     

禽肉产品中禽流感与新城疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单项RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立的多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感、新城疫的极限分别为10-2.5 EID50/0.1 mL和10-3.75 EID50/0.1 mL,mRT-PCR检测禽流感的敏感性与sRT-PCR一致,mRT-PCR检测新城疫的敏感性较sRT-PCR敏感性下降2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR仅检测到不同亚型(H1、H3、H5、H6和H9)禽流感、不同毒力新城疫病毒,对其他9种禽病原体和SPF鸡尿囊液均未扩增出片断。mRT-PCR检测39株禽流感H1、H5和H9亚型病毒、41株不同宿主源新城疫病毒,结果与sRT-PCR、HI试验完全一致;mRT-PCR和病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,2种方法检测禽流感的符合率为93.8%(30/32),检测新城疫的符合率为95.2%(20/21);采用mRT-PCR和病原分离法同时对35份进口禽产品、32份鸡粪拭子检测,2种方法检测禽流感的符合率为100%(67/67),对新城疫的符合率为97.1%(65/67)。病原分离法的检出率虽高于mRT-PCR,经统计学分析,两者差异不显著。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR诊断方法的建立

利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,在优化单项RT-PCR条件的基础上,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法,同时对该检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp,初步建立了快速、敏感、特异鉴别检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒的分子诊断方法。     

H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒(AIV)WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠,对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型,ELISA检测效价分别为1∶10~3和1∶10~5;HI效价分别为2~(15)和2~(14);2株单抗均具有鸡胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定,结果显示均为针对HA蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。     

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

禽流感病毒H5,H7,H9亚型多重RT-PCR检测方法的建立

依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出.     

Maternal Antibody Protected Chicks from Growth Retardation and Immunosuppression Induced by Early Reticuloendotheliosis Virus Infection

To determine if the maternal antibody from breeders vaccinated with cell culture-adapted reticuloendotheliosis virus （REV） could protect chicks from early REV infection, one-day-old chicks with or without anti-REV maternal antibodies were inoculated with REV, and then their growth rates and antibody titers to Newcastle disease virus （NDV） and avian influenza virus （AIV）, after vaccination with inactivated vaccines, were compared. This study indicated that REV infection could cause growth retardation and severely inhibit immune reactions to inactivated vaccines against NDV and Avian influenza virus （AIV, H9 and H5） in one-day-old broilers without maternal antibodies specific to REV. Maternal antibody from breeders vaccinated with an attenuated REV vaccine effectively protected REV-challenged birds from growth retardation and immunosuppression on antibody reactions to NDV and AIV vaccines. Four weeks after vaccination, the HI titers to NDV, AIV-H9, and AIV-H5 in maternal antibody positive and negative groups were 3.36 ＋- 2.04 versus 1.58± 1.69 （P〈0.01）, 6.27±3.87 versus 0.71 ± 1.60 （P〈0.01）, and 6.72±3.92 versus 0.54± 1.44 （P〈0.01）. Maternal antibodies from breeders vaccinated with REV vaccine could successfully protect chicks from REV infection and effectively prevent REV-induced growth retardation and immunosuppression in antibody responses to NDV and AIV.     

3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性

【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒（AIV）对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组（空白对照组和3个感染组）。感染组每组以100μL稀释至106EID50/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量（EID50）在10-6.0/0.2 m L～10-6.8/0.2 m L,半数致死量（ELD50）在10-6.8/0.2 mL～10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同...     

一步法多重RT-PCR禽流感病毒分型诊断法的建立与应用

根据禽流感病毒(AIV)的M基因序列设计合成了1对AIVM基因的通用诊断引物AMDI／AMD2,针对H5N1、H9N2两种亚型的HA基因分型设计合成了2对分型诊断引物H15D1／H5D2,H9D1／H9D2。采用一步法多重RT-PcR技术建立了一种禽流感病毒快速分型诊断方法,并对其特异性和灵敏度进行验证。结果表明,该诊断方法速度快,一般只需要28～30 h即可鉴定出结果,比病毒分离鉴定(5～7 d)至少缩短4～6 d;特异性强,试验组53株AIV全部扩增出与预期同样长度的目的条带,与病毒分离及血清学鉴定方法的检测结果完全一致。对照组中新城疫病毒(NDV)、减蛋综合征病毒(EDS76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)均未扩增出特异性基因条带,;灵敏度高,试验组将AIV接种SPF鸡胚,培养后的鸡胚尿囊液(AAF)进行10-2稀释后,仍可以检测到其中的AIV。