水稻穗期活体植株对潮霉素的敏感性分析及突变体选育

携带潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的转基因作物细胞和组织对抗生素潮霉素具有一定耐性,是作物尤其是单子叶作物遗传转化中常用的选择基因。本研究旨在建立一种活体植株潮霉素抗性快速鉴别技术,用于转基因育种和相关研究。在始穗期前后,用不同浓度潮霉素B溶液(25～100mg/L)喷洒常规及转基因水稻植株,考察叶片和谷粒的中毒症状。发现常规水稻在高于50mg/L的潮霉素溶液处理后,叶片出现褐色斑点,稻穗部分谷粒颖壳呈黄褐色的中毒症状,叶片斑点和黄褐色谷粒的数量均随剂量增大而增加。经100mg/L潮霉素处理后,籼稻品种嘉优99和C10剑叶每平方厘米平均斑点数目为21.1和19.2个,穗上黄褐色谷粒比例分别达27.6%和23.5%;粳稻品种嘉优5号和R5叶片中毒斑点数为11.8和10.7个,黄褐色谷粒比例分别为11.2%和11.9%,表明2份籼稻材料较2份粳稻材料对潮霉素更为敏感。在上述浓度范围内,携带HPT的转Bt基因水稻克螟稻1号均未出现中毒症状。对γ射线诱变处理克暝稻的M2群体(共12万株)穗期喷施100mg/L的潮霉素B溶液,从中筛选到42株潮霉素敏感型突变体,组织化学法分析表明这些植株具有β-葡萄糖苷酸酶GUS活性。对能够取到较嫩叶片的14个单株采用离体叶片法进行抗虫性鉴定,证明这些植株对二化螟仍然表现高抗。上述结果表明,在始穗期喷施100mg/L潮霉素溶液,潮霉素敏感植株可出现明显、直观的中毒症状,可以在活体植株水平上有效鉴别植株是否携带HPT,可用于育种中转基因植株的筛选或转基因安全评估中植株的鉴别。     

潮霉素磷酸转移酶（hpt）基因的原核表达、蛋白纯化及其抗体制备

从转基因玉米(Zea mays)基因组上成功地克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接,成功构建了pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中进行蛋白表达.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了HPT蛋白,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白.用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔制备了特异性强、灵敏度高的多克隆抗体.     

潮霉素磷酸转移酶的原核表达纯化及其抗体制备

本研究从转基因玉米基因组上成功克隆出潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),通过BamHⅠ和Hind III 双酶切作用,将hpt基因与pET30a进行粘性末端连接成功构建pET30a-hpt质粒,并转化到大肠杆菌BL21中进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,pET30a-hpt融合表达载体在大肠杆菌BL21(DE3) 菌株中以可溶性蛋白的形式高效表达了潮霉素磷酸转移酶（HPT）,并通过金属鏊和层析纯化了目的蛋白。用肠激酶切除了融合蛋白的融合部分之后再一次通过金属鏊和层析,经过透析后获得了HPT纯品,并且使用纯化的HPT蛋白免疫兔子制备了特异性强的多克隆抗体。     

一种快速检测转基因水稻中潮霉素抗性的简易方法

潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphtolransf-erase,hph)基因被证明是一个十分有效的用于植物,尤其是水稻和玉米等禾谷类作物的选择标记基因.由hph基因编码的潮霉素磷酸转移酶可将磷酸基团共价地加到潮霉素B(HygromycinB)的第4位上,从而使受体细胞产生潮霉素抗性(Grita等1983);经潮霉素抗性筛选后,对转化细胞不产生或很少产生毒害作用,再生植株的可育性也较好(Ayres等1994).因此,在大多数有关转基因水稻的研究中,均以该基因作为抗性选择标记.在获得转基因水稻植株后,对其后代植株中潮霉素抗性的检测目前都采用将转化的苗或后代种子接种于含一定潮霉素浓度的选择培养基中,观测小苗生长或种子萌发情况,以判断并筛选抗性植株.     

水稻与冬小麦对臭氧的反应及其敏感性试验研究

利用OTC－1型开顶式气室对我国主要粮食作物水稻、小麦进行不同O3浓度的长期接触试验结果表明，O3浓度增加可促进水稻发育，小麦前期发育缓慢，后期衰老加快。水稻和小麦灌浆期缩短、株高下降；随着通气时间的延长，干物质量降低。小麦叶片含水率呈抛物线型下降，但对水稻影响不大；在同样高浓度O3环境下水稻叶片受害较小麦晚、发展慢；O3浓度增加，单株产量和千粒重下降，且小麦减产幅度大于水稻，小麦对O3的反应比水稻敏感。     

低剂量~(60)Coγ射线对水稻幼苗SOD活性的影响

水稻露白种子经~(60)Coγ射线辐照,剂量率0.6111Gy/min,剂量0～61.11Gy,测定其幼苗 SOD 活性及苗高。结果表明:在0～43.65Gy 范围内,幼叶 SOD 活性无明显变化;当剂量达52.38Gy 以上时,活性有所增高。13.10～34.92Gy 可促进幼苗生长,而43.65Gy 以上剂量会抑制幼苗生长。     

同步辐射(软X射线)对冬小麦的诱变效应及机理研究 Ⅰ.同步辐射的辐射生物学效应

本文利用同步辐射 (软X射线 )辐照 3个冬小麦品种 ,从形态学、细胞学上研究了M1 代生物损伤和M2 代诱变效应。结果表明 :同步辐射抑制了M1 代幼苗、植株的生长 ,引起育性、结实率下降 ,M1 代的生理损伤在幼苗生长早期大于γ射线 ,在生育晚期则小于γ射线。细胞学研究表明 ,同步辐射抑制了细胞有丝分裂 ,明显地降低了细胞分裂指数 ,引起了细胞染色体的结构损伤 ,染色体畸变类型不同于γ射线 ,造成的生物损伤大于γ射线。同步辐射诱发了M2 代较宽的突变谱 ,出现了多种有益性状变异 ,适宜的诱变剂量范围为 2 0 0～ 2 5 0Gy ,小于γ射线 (2 5 0～ 35 0Gy)。     

水稻淀粉分支酶基因(RBE4)作为转基因水稻基体标准物质的内标准基因的研究

内标准基因(endogenous reference gene)是指具有物种专一性、不显示等位基因变化、拷贝数恒定的保守DNA序列,对基因定量分析时具有重要意义.本研究选取了5个水稻内标准基因:根部表达的水稻基因(rice root-specific,GOS9)、磷脂酶D基因(phospholipase D,PLD)、蔗糖磷酸合成酶基因(sucrose phosphate synthase,SPS)、水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)、泛素蛋白基因(ubiquitin 5,UBQ5)和2个外源基因:苏云金芽孢杆菌CrylAb杀虫晶体蛋白基因CrylAb和cryl Ab/cryl Ac融合杀虫晶体蛋白基因(CrylA c/CrylAb),分别以转基因水稻(Oryza sativa L.)克螟稻2号和TT51-1为模板,比较各自的外源基因(CrylAb =KMD2和CrylA c/CrylA b=TT51-1)与5个内源基因的PCR产物量,筛选出和外源基因PCR产物量最接近的内标准基因为RBE4.在此基础上,数字PCR不依赖于已知浓度的标准曲线来定值,可以避免标准样品的标准曲线和样品目的基因的扩增曲线在扩增效率上的不一致等因素所带来的误差,定值结果更加准确、可靠,采用数字PCR分析外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值,荧光定量PCR方法分析内标准基因RBE4和外源基因的定量检测稳定性、灵敏度等.结果表明,外源基因拷贝数与内标准基因RBE4拷贝数的比值在转基因水稻克螟稻2号和TT51-1上都较接近于1∶1,分别为115.9％和105.3％.RBE4的荧光定量PCR体系重复性、定量检测稳定性和灵敏度好,符合作为转基因水稻基体标准物质定量分析的内标准基因的要求,RBE4定量体系在TT51-1和克螟稻2号的最小检出限(LOD)分别为5～11 copies/μL和3～12 copies/μL,最小定量限(LOQ)分别为11～22和12～24 copies/μL.RBE4是转基因水稻标准物质研制和产品定量检测的适宜内标准基因.研究结果为转基因作物标准物质研制和定量检测的内标准基因选取提供一定的参考.     

转几丁质酶基因水稻对土壤化学性状及酶活性的影响研究

对种植转几丁质酶基因水稻“竹转68”农田土壤化学性状的变化研究结果表明，当年种植和连续2年种植转基因水稻“竹转68”农田土壤有机质、可溶性N、P以及过氧化氢酶、多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性与非转基因水稻对照相比无显著差异，且其叶片的化感作用大于非转基因水稻对照，但其腐殖过程化感效应及残体腐殖速度均小于非转基因水稻对照；经过冬季腐殖过程2种水稻土壤腐殖化程度基本一致，表明种植转基因水稻“竹转68”对水稻生产不会产毕不利影响．     

转基因抗虫水稻矮秆突变体的品质性状分析

对转cry1Ab基因抗虫水稻矮秆突变体的品质性状与原亲本秀水11进行了对比分析,发现在最高粘度、热浆粘度和冷胶粘度等RVA谱特征值上两者有显著差异,而在外观品质、碾磨品质、表观直链淀粉含量、胶稠度和淀粉粘滞特性的崩解值、消减值等淀粉食用品质方面基本相同,在蛋白、脂肪、灰分、矿物质和氨基酸等关键营养成分上也不存在显著差异,在蒸煮后的矮杆突变体米粒中也未检测到Cry1Ab杀虫蛋白。     

Bt水稻杀虫蛋白时空变化及秸秆还田后在土壤中的持留规律

以Bt抗虫水稻华池B6、TT51及其非转基因水稻亲本嘉早935、明恢63,以及与它们亲缘较远但农艺性状相近的水稻品种中九B、R9311为试验材料,研究了田间种植条件下Bt抗虫水稻杀虫蛋白的时空变化及其在根际土中的持留规律,同时,还研究了秸秆还田后Bt蛋白在土壤中的持留规律。结果表明：1）Bt抗虫水稻华池B6植株各个部位...     

HPT-ELISA方法的建立及其在转基因水稻监测中的应用

本文改进了HPT-ELISA检测法,利用一种简便并且高效的微生物表达体系,将hpt基因的全编码序列克隆到原核表达质粒pGEX-KG上,在E.Coli菌株BL21(DE3)-pLys中进行诱导表达,获得了融合蛋白GST-HPT,经Thrombin凝血酶酶切过夜,再经过柱纯化后获得不含GST且具有生物活性的HPT纯蛋白,所得蛋白纯度>90%。MALDI-TOF-MS分析表明,HPT蛋白分子量为39.4KD。用HPT纯蛋白免疫家兔,制备了高效价的多克隆抗体,进而构建了双抗夹心酶联免疫检测方法,其灵敏度为0.31ng/ml。应用该HPT-ELISA方法,测定了不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达水平以及成熟期稻米中的HPT蛋白含量。结果表明,不同生育期转Bt基因水稻植株中HPT蛋白的表达量约为15.67~60.12ng/g.FW,转Bt基因稻米中HPT蛋白的含量为5.28ng HPT/g.FW,而在非转基因亲本的植株和稻米中均未检测到HPT蛋白。     

水稻耐辐射损伤的QTL分析

利用水稻品种珍汕97B/密阳46所构建的RIL群体及其遗传图谱, 以350和550Gy γ射线辐照成熟种子,以相对发芽率和相对成苗率作为考察其耐辐射损伤指标,进行QTL加性效应和上位性效应分析。结果表明,RIL群体受不同剂量辐照后,株系间表现出耐辐射损伤的差异。350Gy剂量处理共检测到2个耐辐射的加性效应QTL,其中qRR(g)8-1（相对发芽率为指标）有效基因来自于父本,其遗传贡献率为653%;qRR(s)2-2（相对成苗率为指标）有效基因来自于母本,其遗传贡献率为1281%。550Gy剂量处理共检测到4个耐辐射的加性效应QTL,其中以相对发芽率为指标,检测到的qRR(g)1-2和 qRR(g)8-2,其有效基因分别来自于母本和父本,共可解释1438%变异;以相对成苗率为指标,则检测到qRR(s)5-2和qRR(s)10,共解释1965%变异。在不同剂量处理下,还检测到9对双基因相互作用。比较表明,水稻耐辐射损伤的QTL表达可能与辐照剂量有关。     

重金属胁迫对水稻叶片过氧化氢酶活性和同功酶表达的影响

本文报道了浓度为 0 0 5～ 2 0mM的重金属Cu、Cd、Hg胁迫对 3个不同类型水稻品种幼苗叶片过氧化氢酶 (CAT)活性和同功酶表达的影响。结果表明 :( 1 )在胁迫浓度为 0 0 5～ 2 0mM范围内 ,CAT活性随Cu和Cd浓度的增高而持续下降 ;CAT活性随Hg浓度的增高表现为先下降 ,再略有升高 ,然后又明显下降 ,表明浓度为 0 0 5～ 2 0mM的Cu、Cd、Hg胁迫显著抑制 3个不同类型水稻品种幼苗叶片CAT活性。( 2 )应用聚丙烯胺浓度梯度电泳对CAT同功酶分析显示 ,正常情况下水稻叶片中有 1～ 2个CAT同功酶的表达 (武育粳叶片中表达 2个 ,扬稻 6号和汕优 81 8叶片中表达1个 )。 0 1mM的Cd胁迫能诱导武育粳叶片 ,0 1mM的Cd和Hg胁迫能诱导扬稻 6号叶片表达 1个新的CAT同功酶。尽管如此 ,正常表达的CAT同功酶仍受到重金属Cu、Cd、Hg胁迫的抑制     

种植转双价抗真菌基因水稻对根际微生物群落及酶活性的影响

对转几丁质酶和葡聚糖酶双价抗真菌基因抗病水稻七转39种植后的根际土壤微生物群落和酶活性进行了分析。研究结果表明,七转39根内生真菌和细菌数量显著低于非转基因阴性对照七丝软粘和常规水稻竹籼B,根际土壤中真菌和细菌数量也少于七丝软粘,与竹籼B数量接近。在水稻抽穗期测定,转基因水稻根际土壤过氧化氢酶、多酚氧化酶、蔗糖酶和脲酶活性以及可溶性有机质、氮、磷含量均与对照无显著差异。转基因水稻残体腐解过程中土壤腐殖酸含量变化与七丝软粘一致。与对照相比, 种植七转39未对下茬水稻的生长产生显著影响。     

EMS诱变水稻矮生资源的鉴定评价

用甲基磺酸乙酯(EMS)处理水稻优良籼型恢复系缙恢10号,获得了24份半矮化突变体,其中4份较为特别.与其他半矮化突变体相比,d11和d24的包穗程度较轻,分别为-2.7和-2.6cm,农艺性状变化较小,有效穗与原始材料相比无变化;缙恢10号对GA3敏感,d9和d18对GA3钝感,d9是全节间缩短型突变体,d18则为顶...     

不同处理对水稻病程相关蛋白和过氧化物酶的影响

以稻白叶枯菌 (Xanthomonasoryzaepv.oryzae.XOO)弱毒株 75 1和Ni(NO3) 2 作为诱导因子处理水稻幼苗。表明不同处理均在第 2d表现出最大诱导效果 ,Ni(NO3) 2处理后的相对诱导效果达 50 8% ;可溶性蛋白质IEF和SDS PAGE显示 ,诱导蛋白一般在诱导后 2 4h及 48h出现。Ni(NO3) 2 处理后 48h ,SDS PAGE发现上位叶有新增谱带 (MW分别为 54 95和 3 2 3 6kD) ;IEF显示上位叶出现pI5 1谱带 ,诱导叶出现pI5 2 6谱带 ;POD同工酶诱导叶新增加 4条酶带 (Rf分别为 0 62、0 63、0 64及0 73 ) ,上位叶新增加两条酶带 (Rf为 0 63和 0 64)。不同诱导因子处理后 ,可溶性蛋白质含量增加 ,诱导后 2 4～ 48h增幅最大 ;还显示不同诱导因子对同一植物诱导PRP的效力不同     

双季杂交早稻秧苗素质对产量及内源激素水平的影响

以产量性能差异大的双季杂交早稻超级稻品种淦鑫203和对照品种淦鑫206为材料,比较了2个品种不同秧苗素质下分蘖动态、产量及其构成因素的差异性,测定了水稻各主要生育阶段倒二叶内源激素含量,分析了其与产量形成的关系。结果表明:2个品种低素质秧苗条件下的产量及其构成因素均呈现不同程度下降,淦鑫203和淦鑫206低素质秧苗较正常秧苗单产分别下降6.23%和8.60%,单株有效穗数、每穗总粒数、结实率、千粒重分别下降8.70%和17.00%、6.65%和1.89%、1.31%和3.35%、2.08%和0.78%;低素质秧苗下,淦鑫203较淦鑫206单株茎蘖数的起降幅度更为平缓,成穗率更高;随生育推进,2个水稻品种不同素质秧苗大田期倒二叶ABA含量均持续升高,ZR含量持续下降,但淦鑫203变化幅度均较淦鑫206更为平缓;IAA、GA3含量变化则表现为先升后降趋势,至抽穗期达峰值,淦鑫203明显高于淦鑫206;同时IAA和GA3含量各主要生育时期均为低素质秧苗下较低,且其变化幅度更大;低素质秧苗下,从分蘖盛期至乳熟期淦鑫203倒二叶生长促进类激素总和(IAA+ZR+GA3)与生长抑制类激素ABA的比值均高于淦鑫206,且其总体下降也更平缓;淦鑫203不同素质秧苗下齐穗后生长促进类激素ZR、IAA和GA3与ABA的比值均高于同期淦鑫206;2个品种不同素质秧苗下产量及其形成、分蘖动态及4种内源激素的产生与调节方式存在差异,认为苗期逆境胁迫导致低秧苗素质,大田恢复正常管理下反弹性生长补偿能力与品种产量稳定性能有关。