单链抗体hs83基因植物表达载体的构建

成功构建了单链抗体hs83基因植物表达载体pCAMBIA1301-hs83。首先根据基因的序列重新设计了两条含有合适酶切位点的引物,酶切位点保证了基因能够插入取代pCAMBIA1301上GUS基因的第二外显子;第二步是PCR反应克隆目的基因,然后连接到pMD-18T载体,进行测序鉴定;第三步是对pCAMBIA1301质粒和T-hs83质粒进行双酶切,释放出两个目的片段,分别回收后连接,酶切鉴定后将重组子通过冻融法转化根癌农杆菌EHA105,并用PCR法进行鉴定。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

拟南芥CBF1基因植物表达载体构建及其对野生蕉的遗传转化

从拟南芥中克隆CBF1基因,转入到植物表达载体pBI121的XbaI和SacI位点,得到中间重组质粒pBI121-CBF1,用EcoRI和HindⅢ将35S启动子与CBF1基因从pBI121-CBF1切下,转入到植物表达载体pCAMBIA1301中,构建植物表达载体p1301-CBF1.将构建的植物表达载体转入农杆菌E...     

ETR1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

[目的]构建拟南芥乙烯受体(ETR1)特异性短发夹环RNA(shRNA)真核表达载体。[方法]从ETR1基因cDNA序列上选取目标序列,设计2对引物,经PCR扩增得到正反向2个DNA片段(S5I和AI),构建含有该正反向互补重复序列DNA片段的中间载体,测序分析正确后再克隆到植物表达载体pCAMBIA1301中的Gus位置并经双酶切证实。[结果]ETR1基因S5I和AI片段被成功克隆进质粒pCAM-BIA1301中,酶切鉴定及测序分析显示,重组质粒shRNA编码序列与设计片段的序列完全一致。[结论]ETR1靶向RNA干扰重组体的成功构建,为进一步获得拟南芥乙烯受体基因的功能缺失突变体奠定良好基础。     

冷相关转录因子CBF2基因的克隆及其植物表达载体的构建

从拟南芥Columbia基因组DNA中分别克隆了CBF2基因和低温诱导型启动子Rd29A。测序结果显示：克隆的CBF2基因长725bp,编码216个氨基酸,与GeneBank公布的的序列相比对,核苷酸同源性为99．8％;启动子Rd29A全长为956bp,与已报道的该启动子序列比较,其核苷酸同源性为99．5％。以双元载体pCAMBIA1301为基础,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF2,为利用CBF2基因提高植物的耐寒性创造了条件。     

本氏烟抗细胞凋亡基因NbDAD1克隆及遗传转化研究(英文)

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因 NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究。[方法]通过 RT-PCR 技术分离本氏烟 NbDAD1 基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株。[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIA1301-NbDAD1和pCAMBIA1301-NbDAD1HAtag;共获得3个基因型50株T0代抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测 PCR 呈阳性。[结论]该试验为研究 NbDAD1 基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨 DAD1 蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础。     

本氏烟抗细胞凋亡基因NbDAD1克隆及遗传转化研究

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究。[方法]通过RT-PCR技术分离本氏烟NbDAD1基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株。[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIA1301-NbDAD1和pCAMBIA1301-NbDAD1HAtag;共获得3个基因型50株T0代抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测PCR呈阳性。[结论]该试验为研究NbDAD1基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨DAD1蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础。     

水稻RACK1基因过表达载体的构建与转化

利用过表达基因技术将从水稻中分离克隆的RACK1基因定向克隆至植物中间表达载体pCAMBIA1301中,构建了RACK1过表达融合基因植物表达载体pCAMBIA1301/R,通过根癌农杆菌EHA105将其导入水稻基因组。对获得的抗性植株的报告基因、基因组PCR及Southern Blotting进行检测分析。结果表明,该过表达基因已整合到水稻基因组中。     

人参SQS和SE酶基因的克隆及其表达载体的构建

鲨烯合酶(SQS)和鲨烯环氧酶(SE)是人参皂苷生物合成过程中的关键酶。以五年生人参叶片为供试材料提取总RNA,根据GeneBank上已发布的SQS和SE基因登录号(AB010148和AB122078),查找对应序列并设计特异性引物,运用RT-PCR方法,通过构建pMD18-T重组质粒、测序分析,成功克隆到大小分别为1440bp的SQS基因和1780bp的SE基因。同时还构建了这2个基因的表达载体pCAMBIA1301-SQS和pCAMBIA1301-SE,从而为分子水平上探讨三萜皂苷生物合成机理及其在药用植物中的应用提供试验材料。     

虾青素合成关键酶基因bkt植物表达载体的构建 及对玉米的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(Bkt)是由玉米黄素合成虾青素生物合成途径中的关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法从pET-28a( )bkt中扩增得到bkt基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,最终获得带有选择标记和报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301-bkt。通过农杆菌LBA4404介导将其转化进入玉米自交系齐319,转化后的愈伤经GUS组织化学染色分析表明bkt基因已经转入玉米胚性愈伤组织。     

虾青素合成关键酶基因bkt和CrtR-B双价植物表达载体的构建及对花生的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(BKT)和β-胡萝卜素羟化酶(CrtR-B)是虾青素的生物合成途径中的两个关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法分别从pET-28a(+)-bkt,pET-28a(+)-CrtR中扩增得到bkt和CrtR-B基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV 35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,再用CrtR-B基因替换pCAMBIA1301中的另一个GUS基因,形成CrtR-B基因表达盒,最终获得带有抗性基因的双价植物表达载体pCAMBIA1301-bkt-CrtR。通过农杆菌EHA105介导将其转入花生(花育23),获得了经卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,花生基因组中含有这两个基因。     

番木瓜PL和β-Gal基因双价反义表达载体的构建

在已报道的番木瓜果胶裂解酶(PL)和β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因序列的基础上,设计特异引物,分别扩增保守区序列,将其分别反向插入植物表达载体pCAMB IA1301-35S-GUS-Nos的CaMV35S启动子和Nos终止子之间,构建反义表达载体pCP和pCG.然后用2种不同的方法将带有完整启动子和终止子的PL和-βGal基因引入pCAMB IA2301中,获得PL和β-Gal基因的双价植物反义表达载体pCPG,并对2种方法进行比较.     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

棉花生长素应答因子ARF3功能的初步分析

生长素应答因子(auxin response factor,ARF)是转录因子的一个家族,在生长素信号传导途径中起着关键的作用。通过GenBank上登录的序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增得到了陆地棉生长素应答因子ARF3的全长序列,并构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,借助真空渗透转化技术,在农杆菌GV3101介导下转化模式植物拟南芥,经潮霉素筛选,得到了批量的转基因植株。通过PCR技术,检测到目的基因成功整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测到了目的基因在转基因植株中得到表达。     

乙肝表面抗原植物表达载体构建及转化烟草的初步研究

为了探索用植物表达乙肝病毒抗原的可能性 ,将乙肝表面抗原基因插入带有 GUS报告基因的双元载体 p CAMBIA1 30 1。构建成转化烟草的双元载体 p CAMBIA1 30 1 s。用电击法将重组载体转入农杆菌 ,再侵染烟草。用抗生素筛选后 ,抗性小苗 PCR及 GUS染色呈阳性。表明这种载体不但能成功表达病毒蛋白 ,还具有快速鉴定转化株的优点     

小黑杨CYCD3;3基因启动子序列分析及其在拟南芥中的表达

通过相关网站及生物信息软件对Poptr:CYCD3;3基因启动子序列进行详细分析,从小黑杨(Populus)叶片总DNA中克隆到2 000 bp的目的片段,构建植物表达载体(p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3),并利用浸花法转化野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana);通过抗性筛选和分子检测结果显示,p CAMBIA1301-Promoter:CYCD3;3基因已经整合到拟南芥基因组中。同时对获得的转基因幼苗进行GUS染色并观察,其基因表达模式主要集中在植物分生组织中,由此表明Poptr:CYCD3;3调控CYCD3;3基因在细胞分裂中发挥作用。