橡胶树 HMGS 编码基因的分离鉴定

羟甲基戊二酸单酰辅酶 A 合成酶（HMGS）将乙酰辅酶 A 转化为羟甲基戊二酸单酰辅酶 A,是甲羟戊酸代谢 途径的限速酶之一。本研究从橡胶树热研 879 和热研 7-33-97 品系的胶乳中分离出 HbHMGS1 和 HbHMGS2 基因。相比 HbHMGS1 基因在胶乳和树皮中的共表达模式,胶乳中高丰度表达的 HbHMGS2 基因可能是乳管细胞中参与天然橡胶合 成的主效基因,而 HbHMGS1 是功能冗余基因。HbHMGS2 基因在橡胶树高产品系热研 879 胶乳中的表达量亦高于测序 品系热研 7-33-97,表明 HbHMGS2 基因的高水平表达可能有助于橡胶的合成。其上游启动子的顺式作用元件差异可能 与该基因在热研 879 和热研 7-33-97 的差异表达有关。HbHMGS2 基因的转录亦受茉莉酸诱导,可能参与了茉莉酸信号 调控天然橡胶的合成过程。HbHMGS2 基因在大肠杆菌中成功表达为后续研究该基因的功能、利用该基因生产活性物质 提供新的基因资源。     

巴西橡胶树胶乳表达ABC转运蛋白HbGCN1的克隆与表达研究

橡胶生物合成是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢,它是影响橡胶产量的首要因素。ABC转运蛋白(ATP Binding Cassette transporter,ABC transporter)是一类与植物次生代谢密切相关的蛋白大家族。筛选已构建的茉莉酸诱导橡胶树胶乳消减文库,并克隆了1个GCN(general control non-repressible)亚族ABC转运蛋白基因EST,通过RACE技术获得其全长cDNA序列,命名为HbGCN1。该基因开放阅读框共1 815 bp,编码605个氨基酸残基。表达分析表明:HbGCN1主要在橡胶树树皮及胶乳中表达,且在乙烯、茉莉酸或伤害诱导下上调表达,推测其可能与橡胶生物合成相关。原核表达该基因,为进一步的研究奠定基础。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

割胶、机械伤害和外源茉莉酸对橡胶树乳管细胞防卫蛋白基因表达的影响

为了进一步探明巴西橡胶树乳管的防卫功能,笔者采用RT-PCR和Northem-blot技术分析割胶、机械伤害和外源茉莉酸对胶乳几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和橡胶素基因表达的影响,结果表明:(1)外源茉莉酸和机械伤害均能上调几丁质酶、β-l,3-葡聚糖酶和橡胶素的基因表达,但机械伤害的效应滞后于外源茉莉酸;(2)几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和橡胶素的基因在割胶树中的表达明显强于在未开割树中的表达;(3)割胶树胶乳中内源茉莉酸含量显著高于未开割树.     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

巴西橡胶树多聚遍在蛋白基因的表达分析

研究中发现橡胶树胶乳中的橡胶粒子膜上存在遍在蛋白（Ubiquitin)，天然橡胶就是在橡胶粒子上合成的，一些与橡胶合成相关的酶或蛋白就位于橡胶粒子膜上，为了探讨多聚遍在蛋白（Polyubiquitin)基因在天然橡胶合成中可能的调节作用，对橡胶树Polyubiquitin基因的表达进行了研究，Northern blot分析表明，Polyubiquitin基因在橡胶树叶片，树皮和胶乳中都表达，在胶乳中的表达量比叶片和树皮中的高。用外源乙烯和茉莉酸处理的末开割橡胶树和开割橡胶树进行处理后，均可引起Polyubiquitin基因表达增强，未开割橡胶树对外源乙烯和茉莉酸处理比开割橡胶树的反应敏感。     

巴西橡胶树胶乳基因表达

摘 要 　　天然橡胶（顺式-１，４-聚异戊二烯）是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg. ）乳管中合成的一种具有众多工业用途的高分子聚合物。就胶乳中的特异性或高丰度基因而言，它们在橡胶生物合成中可能起着十分重要的作用。     

橡胶树排胶机理与调控研究进展

排胶是巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)树皮乳管细胞中胶乳采收的重要环节,与天然橡胶的生物合成、胶乳再生、割胶技术、韧皮部膨压等众多因素相关,占生产成本的60％以上.近年来,天然橡胶异戊二烯途径合成与调控机制、胶乳诊断指标、乳管伤口堵塞和过度排胶导致的死皮发生和修复机理等领域均取得...     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC1     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

橡胶树HbGAIP-B基因的克隆与表达分析

DELLA是赤霉素信号传导途径中一类重要的阻遏蛋白。本研究通过RT-PCR技术,从橡胶树优良品种‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因(GenBank登录号为KT696440)。该基因全长cDNA序列2135bp,阅读框1905bp,编码634个氨基酸,其编码蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为69.89ku,理论等电点为5.50。HbGAIP-B氨基酸序列与麻疯树JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、拟南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分别为82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。进化树分析表明,HbGAIP-B与JcGAIP-B亲缘关系最近。定量PCR分析表明,HbGAIP-B的表达受割胶处理诱导下调。赤霉素和乙烯利处理4h显著上调HbGAIP-B的表达,茉莉酸甲酯处理4h小幅下调HbGAIP-B表达。     

巴西橡胶树HbCCoAOMT基因克隆及其表达分析

木质素是植物细胞壁的成分之一,其含量高低影响到细胞壁的弹性。橡胶树乳管膨压是割胶后胶乳排出的初动力,乳管细胞壁的物理性能可能是影响乳管膨压的因素之一。本研究采用QRT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的乳管细胞中克隆到一个木质素合成关键酶CCo AOMT基因的同源基因,命名为HbCCoAOMT。该基因的开放阅读框为741 bp,编码1个由246个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为27.76 ku,理论等电点为5.255。实时荧光定量PCR结果表明,割胶和乙烯利处理均下调HbCCoAOMT基因在胶乳中的表达。该基因的表达量以及内层树皮的木质素含量在两个橡胶树品种(CATAS8-79和PR107)间存在显著差异。HbCCoAOMT差异表达可能影响到乳管细胞木质素含量和乳管细胞壁的物理性能。     

巴西橡胶树乳管生物学与胶乳生产

论述了3个限制天然橡胶生产的关键因素,即割胶后排胶持续的时间、两次割胶之间胶乳的再生和乳管从维管形成层的产生。同时说明,对橡胶树自身来说,乳管可能是与机械损伤相联系的一种保护组织,而乳管的形成和功能,能够被包括乙烯和茉莉酸在内的伤害信号高度地调节。     

橡胶树α-维管蛋白基因HbTUA1的克隆及表达分析

利用橡胶树胶乳EST文库克隆到一个TUA基因,命名为HbTUA1（GenBank登录号：KC333454）。该基因cDNA全长1 580 bp,其中5′UTR长45 bp,3′UTR长167 bp,编码区长1 368 bp,编码449个氨基酸。HbTUA1蛋白具有TUA类蛋白保守的GTP结合域。荧光定量PCR分析显示,HbTUA1基因在橡胶树胶乳中的表达量最高,其次是树皮和芽,而在种子和叶片中的表达量最低;在胶乳中,HbTUA1基因的表达显著受割胶和伤害诱导,在不同死皮程度的橡胶树中也存在明显差异。初步表明HbTUA1基因可能参与橡胶树胶乳再生与胁迫应答调控。     

巴西橡胶树次生乳管分化能力早期预测的相关基因初步研究

目前通过常规的试割测产进行橡胶树产量育种的方法,周期长且效率低,亟须改进。橡胶树次生乳管分化能 力是决定橡胶产量的关键因子之一,因此,次生乳管分化能力的早期预测对缩短橡胶树产量育种周期具有重要意义。 本研究采用分子生物学技术,割胶处理不同次生乳管分化能力等级的橡胶树种质的杂交后代,对水囊皮组织中的茉莉 酸生物合成关键酶基因、茉莉酸途径关键环节基因和橡胶生物合成关键酶基因等 20 个基因的表达模式进行分析,并将 基因表达与橡胶树种质次生乳管分化能力等级进行相关性分析。结果发现：茉莉酸生物合成关键酶基因 HbAOCa 和橡 胶生物学合成关键酶基因 HbHevb7 在割胶处理后上调表达,且与橡胶树种质的次生乳管分化能力等级相关性较好。该 方法可用于区分橡胶树种质间次生乳管分化能力的差异。研究结果不仅可以夯实橡胶树种质的乳管分化能力的早期预 测方法,而且可为开发次生乳管分化能力的相关分子标记提供理论基础。     

巴西橡胶树乳管细胞HbWRKY1基因克隆及表达分析

采用PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆了WRKY转录因子家族的一个成员HbWRKY1。该基因全长为1755 bp,含有1个1440 bp阅读框,编码479个氨基酸。生物信息学分析表明,HbWRKY1含有2个WRKY结构域和C2H2锌指结构基序,与蓖麻、杨树、葡萄、黄瓜、拟南芥的WRKY成员的氨基酸序列同源性分别为64.14%、60.04%、42.54%、40.61%和35.4%,属于Ⅰ类WRKY家族成员。实时荧光定量PCR分析表明,割胶和乙烯显著上调HbWRKY1基因的表达,但茉莉酸和机械伤害对HbWRKY1的表达没有明显影响,表明HbWRKY1可能在乙烯信号途径对防卫蛋白的调节中起重要作用。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

橡胶树树皮中ACC氧化酶基因(HbACO7)的表达特性及功能探究

天然橡胶是重要的工业原材料,主要来自橡胶树树皮中的乳管。乙烯能促进橡胶树乳管产胶和排胶,在树皮上施用乙烯利（一种乙烯释放剂）或乙烯可显著提高胶乳产量。基于本课题组前期获得的橡胶树基因组和转录组数据,克隆橡胶树中乙烯合成通路关键酶——1-氨基环丙烷基-1-羧酸（ACC）氧化酶基因家族（HbACOs）的全部8个家族基因,研究其组织表达模式。结果表明：在分析的7种组织中,尽管HbACO基因存在不同程度的冗余表达,但每种基因的组织表达模式具有明显的特异性,其中HbACO7是树皮中表达量最高的家族基因。HbACO7基因的表达在割胶季节的不同月份发生明显变化,其中在8月的表达量最高。成功构建了HbACO7基因的原核表达载体,实现其在大肠杆菌BL21中的诱导表达。纯化后的HbACO7重组蛋白具有明显的ACO酶催化活性,成功地催化了乙烯的体外合成。该结果将为后续橡胶树树皮中的乙烯生物合成调控机制研究提供参考。     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植