TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

利用已修饰的CpTI基因进行转基因检测,根据修饰后的目的基因片段序列对两个甘蔗品种(P44和福农94-0403)的转基因甘蔗进行RT-PCK检测研究,结果在被检测的10 株甘蔗中验证了3株已转入植株中,RT-PCR检测到的20、25、26号植株均呈阳性,证明被修饰的sck基因已成功转入甘蔗.     

应用多重PCR-DHPLC方法快速检测转基因马铃薯及EH92-527-1品系鉴定

以EH92-527-1转基因马铃薯为试材,应用多重PCR技术同时扩增马铃薯的内源基因(UGPase)和外源基因(NOS终止子、NPTII结构基因和EH92-527-1品系特异基因),将扩增产物在DHPLC非变性条件下分离,分析几个基因扩增的结果;将模板进行稀释,确定了方法的检测灵敏度,并与凝胶电泳结果相比较,建立了马铃薯转基因成分筛选检测及品系鉴定的多重PCR-变性高效液相色谱(DHPLC)方法。试验结果表明,该方法能够同时筛选检测转基因马铃薯的四个内、外源基因,且与凝胶成像相比,有更好的检测灵敏度,可达到1 ng/μL。本文首次建立的马铃薯多重PCR-DHPLC检测方法,能够高通量快速准确的检测马铃薯中的转基因成分及对品系进行鉴定。     

利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数

水稻转化过程中,多个拷贝数整合到基因组中影响遗传稳定性和基因表达。传统的Southern杂交检测法鉴定费时费力,不适合目前高通量和自动化的检测要求。因此研究通过比较定量除草剂草铵膦抗性基因(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,建立了基于实时荧光定量PCR的拷贝数检测法。利用此体系对9个独立的异天冬氨酸甲基转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进行了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分离比分析验证,表明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株。     

GmAOC3基因转化载体构建及转化大豆的初步研究

选用内切酶SacⅠ和MluⅠ切割目标基因和载体,构建了携带bar基因的重组载体p BA002-Gm AOC3,选用2个大豆品种(Jack和南农88-1)和2种外植体(子叶节和整个子叶节),研究大豆品种和外植体对根癌农杆菌介导的子叶节转化Gm AOC3基因的影响。结果表明:外植体为整个子叶节的大豆品种Jack的出芽率和转化率最高,分别为79.5%和2.27%。经Quick Stix PAT/bar基因试纸条检测、目标基因的分子检测和草丁膦抗性鉴定,共得到转Gm AOC3基因的T0代阳性株系3株,T1代阳性转基因大豆6株,其中5株以Jack品种为受体的转基因大豆Gm AOC3基因的表达量均显著高于非转基因植株,荧光定量拷贝数检测结果显示,4株转基因单株为单拷贝,2株为双拷贝。     

TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。     

人乳铁蛋白基因转化银耳的研究

利用电穿孔转化法,把携带人乳铁蛋白基因(hlf)的银耳表达载体pCB-hlf导入银耳芽孢菌株Tr21,用PCR鉴定该基因阳性转化子,检测转基因菌株的GUS活性,并用Southern杂交检测hlf的插入位点。结果表明:电穿孔转化法的转化率可达到9.25×106个/μg质粒DNA;抗性筛选的阳性转基因菌株中均能扩增出与预期大小相符的hlf、GUS和Tnos序列,且GUS基因在转基因菌株中均有表达。Southern杂交结果表明,不同转基因菌株hlf的插入位点不同,有些菌株插入了2个或更多的拷贝。RT-PCR结果表明,外源基因在银耳中能正常转录成RNA。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

利用多重PCR技术快速检测五个转基因大豆品系

转基因大豆305423、MON89788、CV127、GTS40-3-2、356043作为商品化应用最为广泛的大豆品系,种植面积占世界转基因大豆总种植面积的80%以上。根据大豆内标准基因Lectin和5种转基因大豆品系的边界序列设计特异性引物。通过验证引物的适用性、特异性和灵敏度,优化多重PCR检测体系中不同引物的用量及反应退火温度,建立了能同时扩增大豆内源基因Lectin和5个转基因大豆品系的六重PCR检测体系。结果表明:确定的大豆内源基因和5个转基因大豆品系的引物具有很好的特异性,引物之间无交叉扩增和非特异性扩增,多重PCR方法的检测灵敏度达到0.1%。该方法可作为转基因大豆及其产品成分检测的辅助手段,快速检测转基因大豆及其产品中的相应品系。     

转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T₂代甘蔗株系进行PCR扩增及测序,从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理,在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下,6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相对表达量始终高于WT甘蔗,低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下,甘蔗的MDA含量逐渐增高,而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗,10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同,但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势,而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升,转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗,胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价,抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下,转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性,且具有遗传稳定性。     

多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究

以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。     

生物技术对甘蔗育种上的潜在影响

自20世纪80年代中期以来，生物技术已在包括甘蔗在内的许多农作物生产上取得了很大进展。与生物技术相关的研究项目已于1994年在路州荷马的美国农业部农业研究院南方研究中心甘蔗研究所的甘蔗育种计划中开始实施。生物技术在育种计划中将会有一个重要影响的鉴定领域是种质评价，特定种与特定特性的DNA标志和转基因甘蔗的生产。在两个商用甘蔗品种和17个甘蔗近缘野生种上进行了5S rRNA位点的DNA序列多态研究。克隆了52个多态染色体组DNA序列，并测定了5S rRNA位点。现在，这些发表自基因银行的序列目前是有用的。以这些DNA序列为基础，设计了三个甘蔗种的特异性的DNA标记，并正被用于帮助后代选择。在既具有抗除草剂和glufosinate,也抗甘蔗花叶病毒H系的转基因甘蔗生产的温室植物评价上，也取得了进展。在新千年里，期望农业研究院和大学的育种家、农学家、遗传学家、病理学家、昆虫学家和生理学家在甘蔗有关生物技术项目上，如鉴定、克隆和基因分子鉴定研究上为提供重要的农艺特性或重要病虫害而多多合作。     

高效快速甘蔗转基因方法探索

甘蔗遗传背景复杂,转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。甘蔗转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌介导法来实现,但目前我国的甘蔗转基因技术,普遍存在转基因效率偏低,获得的转基因株系偏少,难以筛选到目的基因稳定表达、有利用价值的转基因株系等问题。本实验室通过多年的经验积累,建立了一种高效快速的农杆菌介导法的甘蔗转基因方法。转化效率为20%,筛选效率达到90%,转化时间为4个月,操作简单,成本较低。     

甘蔗遗传转化与基因编辑技术研究进展

甘蔗遗传背景复杂,采用常规育种方法进行甘蔗品种选育耗时较长,对亲本的要求也较高,杂交后代分离严重,且会携带一些不需要的基因。利用基因工程可定向导入特定性状的基因,从而培育具有高产量和高价值的作物。文章在系统描述各种遗传转化和转基因技术的基础上,分析农杆菌介导的遗传转化法、基因枪介导的遗传转化法、电穿孔转化法和聚乙二醇(PEG)介导法,发现主要的使用方法为农杆菌转化法和基因枪转化法,电穿孔转化法和PEG介导法存在干扰因素较多,其主要问题是转化效率低、转基因株系鉴定结果不明确,还需进一步完善。基因编辑技术主要是RNAi沉默法和CRISPR编辑法,但甘蔗基因组研究还未取得突破性进展,因此基因编辑仍以基因沉默法为主要手段,可供甘蔗育种中进行遗传转化和转基因技术应用时借鉴。     

转基因玉米MON87427/zSSIIb 二重微滴数字PCR方法建立及应用

实施转基因产品定量标识制度需要建立准确可靠的定量检测技术和方法。数字PCR（dPCR）不依赖标准 物质，实现对DNA分子的绝对定量，已成功用于转基因含量检测和标准物质定值。为建立可靠的dPCR方法，获得 准确测量结果，本研究以耐除草剂玉米MON87427为材料，探索建立二重微滴数字PCR（ddPCR）的策略。以构建的 聚合MON87427转化体和5个玉米内标基因的重组质粒pUC57-M为质控样品，将5个不同的玉米内标基因分别与 MON87427组合，通过优化退火温度，根据阳性微滴与阴性微滴分辨率、中等信号强度雨滴数量及测量值与理论值 的一致性等，确定了二重ddPCR组合为MON87427/zSSIIb，最适退火温度为58.4℃。MON87427/zSSIIb 二重ddPCR的 动力学范围为10～60 000拷贝。对盲样进行定量检测，二重ddPCR的定量结果与荧光定量PCR有良好的可比性， 表明MON87427/zSSIIb 二重ddPCR可取代qPCR方法进行转基因玉米MON87427的定量检测及标准物质定值。     

RNAi干扰油菜Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNAi介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(β-Actin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明：转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNAi干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNAi干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。     

甘蔗转HC-Pro基因的研究

通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。     

转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源E9 3''终止子的检测研究

对转基因抗草甘膦油菜内源特异参照基因BnACCg8和外源基因E9 3’终止子进行了普通PCR和。TaqMan实时荧光PCR检测，建立了相应的检测方法。     

抗虫基因Cry8-like在大豆中的遗传转化及抗虫性初步鉴定

利用无缝克隆技术把抗虫基因Cry8-like重组到pCAMBIA3301载体上,成功构建了含有抗草铵膦筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-RSP-Cry8-like-nos。将该载体通过农杆菌介导法转入两个受体大豆品种吉农28和吉农42中,经PCR检测,吉农28和吉农42分别获得了17株和13株T_1阳性植株,36株和25株T_2阳性植株。T_2转基因植株Southern杂交结果显示,目的基因以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。荧光定量PCR检测结果表明,Cry8-like在转基因植株幼根得到了表达,而非转化受体对照未检测到荧光信号。室内抗暗黑鳃金龟幼虫鉴定结果表明,转基因植株提高了抗暗黑鳃金龟幼虫的能力。