具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆质粒FG12后,构建了表达T7 RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7 RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7 RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7 RNA聚合酶。[结论]T7 RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。     

具有绿色荧光标记的表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系的建立

[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。     

基于T7 RNA聚合酶的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立

    为了建立传染性法氏囊病病毒反向遗传系统,应用PCR法在鸡传染性法氏囊病病毒基因组A、B两节段的5'末端和3'末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,然后分别将含有T7启动子和核酶HDV序列的A、B节段构建到载体PT-Pluc当中,构建感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3(含T7 RNA聚合酶基因,能稳定表达T7 RNA聚合酶)预先感染1 h的vero细胞.细胞病变观测、间接免疫荧光试验、电镜观察和分子标记检测证实成功实现了鸡传染性法氏囊病病毒的遗传拯救.     

细胞外信号调节激酶5RNA干扰稳定细胞系的建立

ERK5通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路家族成员之一,是一种非典型的MAPK通路,也叫做大MAPK通路(Big MAPK/BMK1),可以被各种刺激因素激活,与多种细胞反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程(如脑发育、癌症及糖尿病等)密切相关.采用RNA干扰的方法,用构建的ERK5干扰质粒干扰ERK5表达,通过RT-PCR和Western-blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测ERK5的表达,鉴定干扰效率;通过G418对转染了干扰质粒的鼠恶性黑色素瘤细胞(B16F10细胞)进行稳定筛选,得到ERK5 RNA干扰的B16F10稳定细胞系,为后期的动物实验做准备.

Abstract：

ERK5 (extracellular-regulated kinase 5) signal pathway is a member of the MAPK family. It is an atypical MAPK signal pathway and is also named Big MAPK/BMK1. ERK5 signal pathway can be activated by various stimulating factors, and is closely associated with many kinds of cell responses, such as proliferation, differentiation, transformation and apoptosis. It is also related to the processes of physiological and pathological reactions including the development of brain, cancer and diabetes. In this study,RNAi (RNA interference) was applied to decrease the expression of ERK5. The expression of ERK5 was detected by RT-PCR and Western-blotting. B16F10 cells transformed by constructed ERK5 shRNA plasmids were stably screened using G418, and an ERK5 RNAi B16F10 stable cell line was obtained, whichwas ready for further animal experiments.     

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.     

猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。     

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。     

猪TAF7基因的克隆、染色体定位和组织表达谱分析

 【目的】通过对猪TAF7基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。【方法】以五指山猪为研究对象,克隆TAF7基因,分析该基因结构特点,然后利用IMpRH（the INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid,法国农业科学院-明尼苏达大学的辐射杂种克隆板）分析该基因在猪染色体上定位信息,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因在成年五指山猪16个不同组织（心脏、背肌、淋巴、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、子宫、睾丸、胃、小肠、大肠、卵巢、胸腺、脑、脂肪）的表达谱信息。【结果】克隆得到长1 701 bp的五指山猪TAF7基因序列,其中包括1 050 bp完整CDS（Coding Sequence,编码序列）区域,分析表明其编码含349个氨基酸的蛋白质。利用IMpRH分析结果表明,猪TAF7基因与分子标记SW1879和IL4（interleukin-4,白细胞介素-4）紧密连锁,LOD（Limit of Detection,检测极限）值分别为6.69和6.15。组织表达谱分析结果显示该基因在大多数组织中均有表达,其中在睾丸表达量较高,而在心脏、背肌中表达很低。【结论】猪TAF7基因5’UTR中有一个短的内含子,而在该基因CDS区域没有内含子。猪TAF7蛋白序列与人TAF7蛋白序列的相似性较高,二者在生物系统发育树中的距离最接近。猪TAF7基因在大多数组织中均表达,在猪睾丸中表达量较高,证实它调节目的基因转录具有广泛性。     

稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立

根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株VP2基因序列设计1对引物,将该基因成功克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed2-N1-VP2(简称PVP2);以PVP2作为过渡载体,运用PCR定点突变技术,对第279位点和第284位点的氨基酸残基分别或同时进行突变,共构建P279、P284和PDA 3株突变体;在此基础上构建能稳定表达HZ2株IBDV及其突变体VP2蛋白的Vero细胞系,间接免疫荧光试验检测表明,Vero细胞系中IBDV VP2蛋白已成功表达.这为进一步深入研究IBDV毒力及抗原变异致病机制奠定了基础;此外,利用定点突变技术改造VP2蛋白,建立不同毒力的突变体,在探求高效、廉价的IBDV DNA疫苗上也有广阔的应用前景和重要意义.     

eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克...