茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

茶树阶段性返白现象的初步研究

茶树种质资源中,存在一种具有阶段性返白现象的变异类型,即每年春季,新生叶片呈微绿色,然后逐渐白化至全白色,最后复绿成为绿色。迄今,国内已在浙江安吉和福建安溪发现这种具有阶段性返白现象的茶树品种(俗称白茶)。与白化不同,白茶具有较强的生活力,能够正常生长。在小麦、矮牵牛、樟脑草等其他高等植物上,曾发现过返白突变,如小麦矮变一号中产生的返白突变系,已证实是属于细胞质控制的温度敏感突变型,在返白过程中,叶片颜色的变化与叶绿素含量的变化相一致。在茶树上,1979年日本的乌屋尾忠之发现薮北和与薮北有亲缘关系的品种间杂交后代中有白叶单株分离出来,并证实该白叶植株是由两对隐性纯合基因控制。 本文观察了安吉白茶在阶段性返白整个过程中的表现及其与气象条件的关系,研究了在阶段性返白过程中不同阶段叶片色素的变化规律,并将安吉白茶与福建白茶的白化特征进行了比较。 材料和方法 一、实验材料 1993年田间自然生长的具有阶段性返白现象的安吉白茶和福建白茶;25℃培养室中生长的安吉白茶营养钵苗、试管苗。     

安吉白茶阶段性返白过程中氨基酸的变化

安吉白茶阶段性返白过程中氨基酸的变化＊李素芳１成浩１虞富莲１晏静２（１中国农业科学院茶叶研究所，杭州３１０００８２浙江省安吉县林业科学研究所，安吉３１３３０７）关键词：茶树安吉白茶阶段性返白氨基酸Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｅａ（Ｃａｍｅｌｉａｓｉｎｅｎｓｉ...     

茶尺蠖类免疫球蛋白基因EoHML的克隆和表达分析

类免疫球蛋白（Hemolin）是一种鳞翅目昆虫特有的免疫相关蛋白,也是唯一的无脊椎动物免疫球蛋白家族成员。本实验应用RACE技术获得了茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）类免疫球蛋白基因的全长cDNA序列,命名为EoHML（GenBank登录号：KM885983）,并分析了相关生物信息学特性,检测了病毒感染后基因的表达水平。结果表明,EoHML基因序列全长1β772βbp,包含1β239βbp的开放阅读框,编码412个氨基酸,预测蛋白分子量大小为45.8βkD,等电点（pI）为8.297,属于典型的分泌型蛋白,且具有昆虫Hemolin基因保守的4个Ig功能区和2个N-glycosylation位点。系统进化分析表明,该蛋白与目前已知的类免疫球蛋白氨基酸序列的亲缘关系都较远,与烟草天蛾（Manduca sexta）类免疫球蛋白氨基酸序列相似度最高,为53%。荧光定量检测结果表明,茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）感染茶尺蠖幼虫后该基因表达量显著升高,最高表达量是正常对照的36.5倍,表明茶尺蠖EoHML基因可能参与了茶尺蠖对EoNPV的免疫代谢反应。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

小贯小绿叶蝉半胱氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

半胱氨酸蛋白酶是植食性昆虫体不可或缺的重要水解蛋白酶之一。本文从小贯小绿叶蝉的转录组数据库中获得半胱氨酸蛋白酶基因Eocyp的基因片段的转录本序列,利用RACE技术得到其cDNA全长序列,利用生物信息学技术对Eocyp所编码的理论氨基酸序列进行分析,使用qRT-PCR技术检测Eocyp在小贯小绿叶蝉不同发育阶段,雌、雄成虫不同部位以及不同温度和光周期下的表达量。结果表明,小贯小绿叶蝉Eocyp的全长cDNA序列包含一个1β656βbp的开放阅读框,编码551个氨基酸,并具有由24个氨基酸残基组成的信号肽。推测其相对分子量为62.09βkD,预测其分子式为C₂₇₈₂H₄₁₆₃N₇₃₇O₈₃₅S₂₅;理论等电点为6.02,不稳定系数为36.10。Eocyp具有半胱氨酸蛋白酶基因的典型特征,即催化三联体Cys³⁵⁷-His⁴⁹⁹-Asn⁵¹⁹,同时具有ERFNIN,GNFD和GCDGG簇等保守结构域。Eocyp编码氨基酸序列与茶翅蝽CYP基因编码序列相似度最高。表达特征分析结果表明,Eocyp在小贯小绿叶蝉的各个生长时期均有表达,在5龄若虫时期达到最高;Eocyp在小贯小绿叶蝉雌、雄成虫的腹部均有较高的表达量;然而,Eocyp的表达量对于高、低温和不同光周期均无响应。这些结果为进一步研究Eocyp功能提供了理论依据。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

安吉白茶特异性状的生理生化本质

安吉白茶的特异性主要表现在春季发芽时新梢嫩叶叶色的可逆性白化现象, 在白化过程中新梢的叶绿素含量急剧下降和氨基酸含量显著上升。研究表明, 安吉白茶是一个温度敏感的自然突变体, 其白化表达的温度阈值在20 ～22 ℃之间, 但该温度仅在芽萌发初期发挥作用; 其正常复绿的启动温度在16 ～18℃之间。叶片白化期的主要生理生化变化是叶绿体膜结构发育发生障碍, 叶绿体退化解体, 叶绿素合成受阻, 质体膜上各种色素蛋白复合体缺失, 导致了叶色的变化; RuBP羧化酶的大、小亚基含量及酶活性下降, 同时伴随蛋白水解酶活性的升高, 终因叶绿体不能继续发育, 多余的可溶性蛋白水解, 导致游离氨基酸含量显著上升。文中对其返白机理进行了讨论, 认为该温度敏感型突变体的突变很可能是由核基因或核质互作控制的。     

茶树CLH基因家族的鉴定与转录调控研究及其在白化茶树中的表达分析

叶绿素酶（Chlorophyllase,CLH）是叶绿素降解过程中的关键酶,将叶绿素a脱去植醇,形成脱植基叶绿素a。以白化茶树白鸡冠新梢叶片为材料,克隆获得3条CsCLHs基因cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。结果表明,3条CsCLHs基因分布于2个亚家族,其蛋白质编码区（Coding sequence,CDs）长度为894~975 bp,编码氨基酸个数为297~324,蛋白质分子量为31.99~34.91 kDa,等电点为4.89~7.61,不稳定系数为38.94~48.24,其中CsCLH1.1和CsCLH1.2为不稳定蛋白,CsCLH2为稳定蛋白。Cell-PLoc亚细胞定位预测结果表明,3个CsCLHs蛋白均定位于叶绿体;而WolfPsort亚细胞定位预测结果显示,CsCLH1.1和CsCLH1.2定位于细胞质,CsCLH2定位于叶绿体。遮阴和恢复光照处理下的qRT-PCR结果显示,遮阴抑制白鸡冠叶片CsCLHs的表达,光照诱导白鸡冠叶片CsCLHs的表达。不同品种中CsCLHs表达模式分析表明,CsCLH1s在白化叶中高表达。另外,酵母单杂交结果表明,CsCDF5可以与CsCLH1.1和CsCLH2启动子结合。综上所述,CsCLHs在白化茶树叶片中可能参与叶绿素降解,在叶片白化过程中发挥重要作用,结果可为进一步探究茶树CLH基因家族的功能及茶树叶片白化机理提供参考。     

白叶1号白化过程中叶绿体蛋白质组差异分析

白叶1号是一种温度敏感型白化茶树品种,叶绿体的变化是其产生阶段性白化现象的关键因素。本研究以白叶1号鲜叶叶绿体为研究对象,采用双向电泳、质谱鉴定结合生物信息学分析,研究阶段性白化过程中叶绿体蛋白的表达差异,探讨白叶1号阶段性白化现象的分子机制。结果表明,在白叶1号白化前期、白化期和复绿期叶绿体中分别识别726、748、718个蛋白质,其中差异表达的蛋白59个,质谱成功鉴定22个差异表达蛋白。生物信息学分析表明,差异表达蛋白直接或间接参与了光合作用、应激响应、核酸代谢、物质代谢和未知功能等,其中与光合作用相关的差异表达蛋白最多,占31.82%,表明阶段性白化现象可能与这些生理功能相关。通过荧光定量PCR分析发现,差异蛋白的基因表达与蛋白表达存在一定差异,这可能是由于蛋白质翻译后加工及修饰造成的。上述研究为进一步揭示白叶1号阶段性白化现象产生的分子机制奠定了理论基础。     

番茄泛素活化酶基因家族进化及表达模式分析

泛素活化酶是蛋白泛素化所需的第一个酶,在泛素蛋白酶体途径中发挥重要作用。本文利用生物信息学方法从番茄基因组中鉴定出2个泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme,UBA)基因,命名为Sl UBA1和Sl UBA2。序列分析表明Sl UBA1和Sl UBA2基因的CDS序列长分别为3 060和3 255 bp,分别编码1 019和1 084个氨基酸,编码蛋白分子量为114.15和120.46 ku,分别位于第6和9染色体。2个基因均含有5个内含子,编码蛋白均为酸性、疏水性蛋白;对蛋白二级结构分析发现2个UBA蛋白均以α-螺旋和无规则卷曲为主;亚细胞定位预测均定位于细胞核。序列比对和进化树分析表明番茄UBA基因与其他物种UBA基因相似性高,进化过程非常保守。番茄不同组织表达分析结果表明2个UBA基因在根系和花的表达量较高,果实成熟过程中的表达量相对较低。非生物胁迫试验结果表明:Sl UBA1基因在低温、干旱和盐胁迫下均上调表达;而Sl UBA2基因对非生物胁迫没有明显响应,这些结果表明Sl UBA1基因可能参与番茄对低温、干旱和盐胁迫的响应。     

茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3’/5’RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）的3’端和5’端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框（ORF）1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点（PI）为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

茶树ACC氧化酶基因全长cDNA的克隆与表达分析

ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)氧化酶是植物乙烯合成过程中的关键酶之一,对乙烯的合成具有重要的调控作用。在茶树新梢cDNA文库测序所获得ESTs基础上,利用RT-PCR技术,克隆得到编码ACC氧化酶基因的全长序列,GenBank登录号为DQ904328。该基因长1232bp,编码320个氨基酸残基,预测分子量为36.2kD,等电点5.41。多序列联配表明茶树ACC氧化酶具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树ACC氧化酶的亲缘关系最近。对经高、低温后的不同品种进行RT-PCR分析,结果发现ACC氧化酶基因的表达量与品种的抗逆性有一定的相关性。     

金鱼草花青素糖基转移酶基因的克隆与表达特性分析

以白苏子(Perilla frutescens)花青素糖基转移酶基因为探针,通过电子克隆和RT-PCR的方法从金鱼草(Antirrhinum majus L.)叶片中克隆到花青素糖基转移酶基因(Am GT1)的全长c DNA,并对其表达特性进行分析。结果表明:Am GT1全长892 bp,编码277个氨基酸;进化分析表明Am GT1的氨基酸序列与白苏子的同源性最高为79%,与其他花青素糖基转移酶蛋白的同源性在42%~62%之间,表明Am GT1是从金鱼草中克隆的新的花青素糖基转移酶基因。实时定量RT-PCR分析表明:该基因在金鱼草叶片中的表达量最高,根中的表达量最低;该基因虽然在红色、粉色、黄色、白色花朵中均有表达,但在红色花朵中的表达量最高,且存在一个从紧蕾期到松蕾期的跃变。