抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体1A8的基因克隆及序列测定

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从分泌具有中和活性的抗Ａ型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体（ＭcＡb）的杂交瘤细胞１Ａ８中,扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ基因,用linker（Ｇ１y４Ｓir３） ３基因,将ＶＨ和ＶＬ基因连接成ＳeＦＶ基因,并将其克隆至pＧＥＭ－Ｔ载体中。经核甘酸序列分析证实,ＶＨ和ＶＬ基因及linker基因拼接正确,基因全长７２９bp,经计算机分析,ＶＨ和ＶＬ基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体的基因克隆及核苷酸序列分析

应用 RT-PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体 ( Mc Ab)的杂交瘤细胞 2 E3中 ,扩增出抗体 VH 和 VL 基因 ,用 linker( Gly4Ser) 3基因 ,将 VH 和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆至 p GEM-T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 72 6bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH 和VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 ( B)和轻链κ 家族     

A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯试验

应用硫酸铵盐析、SephadexG 2 5和SephadexG 1 0 0层析的方法提纯A型产气荚膜梭菌α毒素 ,并利用卵磷脂水解试验监测α毒素的析出峰。结果表明 ,以 50 % (W/V)硫酸铵盐析A型产气荚膜梭菌α毒素 ,经SephadexG 2 5过柱后能很好地层析脱盐 ,并初步提纯 ,再经SephadexG 1 0 0层析后则能得到相对较纯的α毒素。该方法快速、简便     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应

用提取的 Ａ 型产气荚膜梭菌 α毒素包涵体免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／ｃ 小鼠后, 取小鼠脾细胞与 Ｓ Ｐ２／０ 骨髓瘤细胞进行融合和克隆化,经间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 筛选,共获得 １ Ａ８、１ Ｃ３、１ Ｄ５、１ Ｄ８、１ Ｆ１、１ Ｈ１ 和 ２ Ｅ３ ７ 株稳定分泌单克隆抗体（ Ｍ ｃ Ａｂ）的杂交瘤细胞株。经鉴定,７ 株 Ｍ ｃ Ａｂ 的 Ｉｇ 亚类有 Ｉｇ Ｇ１（１ Ｄ８）、 Ｉｇ Ｇ３（１ Ａ８、１ Ｃ３ 和 ２ Ｅ３）和 Ｉｇ Ｍ（１ Ｄ５、１ Ｆ１ 和 １ Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为 １∶５１２～１∶１ ０２４ 和 １∶１０６ ～１∶１０８ 。尤为重要的是,２ Ｅ３ 杂交瘤细胞株分泌的 Ｍ ｃ Ａｂ 不仅能够中和 α毒素的磷脂酶 Ｃ活性和溶血活性,而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用。     

感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位

为了研究α毒素在感染A型产气荚膜梭茵动物的体内的分布情况,自制了高效价的兔抗a毒素多克隆抗体作为一抗,HRP和FITC分别标记的羊抗兔IgG作为二抗,通过免疫组化法对α毒素进行了定位检测.结果表明,在小鼠延髓、肠、肾、肺、胃的间充质细胞胞浆中发现了阳性颗粒,在脾、肝的间充质细胞中未发现毒素分布.结果提示,首次在延髓的细...     

A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺

利用全自动机械搅拌发酵罐对A型产气荚膜梭菌α-毒素的生产发酵工艺进行研究。设立温度、pH值和发酵时间3个因素,采用L9(34)正交优化设计方法,确定各因素对A型产气荚膜梭菌α-毒素产毒量的影响程度,并绘制发酵过程细菌生长曲线和产毒曲线。结果显示,pH对细菌的产毒量影响显著(0.01P0.05),发酵时间、温度对细菌产毒量影响不显著(P0.05)。结果表明,pH7.0、发酵温度43℃、发酵时间6 h为A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺条件。     

D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达

为建立产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)α毒素(cpa)克隆表达方法,应用PCR方法从羊源D型产气荚膜梭菌中扩增cpa成熟肽基因序列,将其插入pET-28b载体中,构建重组表达载体pET-28b-cpa;通过PCR扩增、双酶切和测序方法对重组载体进行鉴定及序列分析,然后转入BL21(DE3)pLysS中诱导表达;用SDS-PAGE检测目的蛋白大小及分布,Western blotting方法检测其反应原性。结果表明,所扩增的cpa基因大小为1110 bp,与GenBank参考序列同源性为99%以上;SDS-PAGE分析结果表明,目的蛋白大小为41.2 ku,与预期大小一致,在超声波裂解上清和包涵体中均有分布,但主要以包涵体为主,两者分布均具有和天然毒素相似的反应原性。     

产气荚膜梭菌α毒素基因工程菌表达产物免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因工程菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）经动物试验证实没有毒性。从ＩＰＴＧ诱导后的工程菌中提取包涵体,再辅以氢氧化铝胶制成抗原,免疫小鼠３０ｄ后,用产气荚膜梭菌强毒株培养物上清及培养菌体攻击,结果免疫鼠能抵抗至少２ＬＤ１００的攻击,证明Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＡ１）工程菌株表达产物具有良好的免疫原性。     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

作者对产气荚膜梭菌α毒素的组成、理化性质、生物学特性、检测、结构功能、作用机理、分子遗传及其与氨基酸的组成和细胞膜之间的关系等方面的研究进展作了简要综述。     

CTB-CPA融合基因构建、表达及其产物的免疫原性

构建成含有编码霍乱毒素B亚单位 (CTB)和产气荚膜梭菌α毒素 (CPA)第 70～ 370位氨基酸的融合基因CTB CPA ,并在大肠杆菌中获得表达。经限制性内切酶鉴定和核苷酸序列分析表明 ,CPA基因在重组质粒中与CTB基因的连接向位是正确的 ,位于CTB基因的下游并与CTB基因处于同一阅读框架。重组菌株BL2 1(DE3) (pECTB CPA)经IPTG诱导后 ,其表达产物经SDS PAGE和Western blot检测表明 ,重组菌株可以表达CTB CPA融合蛋白。表达的产物以包涵体的形式存在 ,可分别被抗CT和A型产气荚膜梭菌抗毒素识别 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 7%。用表达产物免疫小鼠后 ,所产生的对A型产气荚膜梭菌毒素攻击的免疫保护力高于用单独的A型产气荚膜梭菌类毒素免疫的小鼠所产生的免疫力 ,证明所表达的融合蛋白中CTB起到免疫佐剂的作用 ,增强CPA的免疫原性     

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)的致病作用一般由它所产生的胞外酶或毒素诱导。主要有α -毒素、β -毒素、θ -毒素及其他的一些胞外酶。本文针对产气荚膜梭菌α毒素的组成、结构、理化性质、作用机理及分子遗传等方面的研究进展作了简要综述。     

羊源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定与进化树分析

无菌采取内蒙古通辽市某羊场病死羊肠道内容物、肝脏和肺脏,进行细菌的分离培养。将从十二指肠内分离到的1株疑似致病菌株进行生化试验、小鼠致病性试验,再将其通过魏氏梭菌多重PCR试验、魏氏梭菌ELISA试验及16S rRNA PCR试验进行鉴定。将PCR产物进行测序并进行了16S rRNA基因的进化树分析。结果显示,经细菌生化试验、多重PCR试验、ELISA试验和16S rRNA试验均证实此分离株为A型产气荚膜梭菌;进化树分析显示该菌与序列号为HQ808749.1(美国)的A型产气荚膜梭菌遗传距离最近。结果表明,该羊病例所分离的致病菌为A型产气荚膜梭菌。     

表达产气荚膜梭菌α—β融合蛋白基因工程菌株的构建

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中护增出α毒素基因，用NcoI和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0.95kb的α毒素基因片段，再用NcoI和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXETB2，与上述回收的α毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中。经NcoI、BamHI、NotI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE3）（pXCPAB2）经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白，该融合蛋白占菌体总蛋白的22.14%。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠，免疫小鼠至少能抵抗2MLD的C型产气荚膜梭菌的攻击。这表明构建的工程菌株BL21（DE3）（pXCPAB2)可以作为预防仔猪红痢基因工程菌苗的候选株。     

产气荚膜梭菌ε毒素蛋白高效表达体系的构建及其免疫保护性的研究

ε毒素是由B和D型产气荚膜梭菌产生的,能够引起牛、羊肠毒血症,给畜牧业造成巨大的经济损失。本试验将ε毒素基因片段(972 bp)以正确的阅读框架定向连接到pET-28a(+)质粒上,然后将重组质粒导入受体菌株,成功构建重组菌株BL21(DE3)。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,重组的菌株BL21(DE3)能以包涵体的形式高效表达ε毒素(占菌体总蛋白的32.83%)。在此基础上,用有效剂量0.2 mg包涵体粗提物免疫家兔,抗血清间接ELISA检测结果显示,在第4周抗体效价达到最高值为8.7log2。因此,在本研究中构建的重组菌株BL21(DE3)能高效表达ε毒素,而且该毒素具有较高的免疫保护性。     

仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究Ⅲ.7株A型产气荚膜梭菌菌株的产毒素试验

本试验对7株A型产气荚膜梭菌菌株在不同培养基、不同培养温度和不同培养时间的产毒力进行了试验。结果表明，培养基的种类和培养时间对菌株的产毒素能力影响较大，而培养温度则影响较小。所试菌株中C57-1菌株的产毒素能力最强，是制备疫苗的最佳菌株。     

产气荚膜梭菌主要外毒素最新研究进展

产气荚膜梭菌是一种重要的人兽共患病的病原体,可引起人的食物中毒和抗生素相关腹泻.近年来,对产气荚膜梭菌的主要外毒素研究取得了重大进展.本文综述了产气荚膜梭菌主要外毒素的组成、结构、理化性质、作用机理、检测及分子遗传学等方面的研究进展.     

产气荚膜梭菌α毒素C末端的三拷贝串联表达与免疫原性分析

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素（CPA） C末端（第247－370位氨基酸,CPA_C）三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因（GenBank登录号：AY823400.1）进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因（GCPA_C3）,片段之间用柔性氨基酸linker （GGGS）连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a （＋）中进行表达与纯化,获得CPA_C的三拷贝重组蛋白（rCPA_C3）。利用Western blotting方法检测rCPA_C3与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rCPA_C3与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量（MLD）的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_C3对家兔的免疫保护效果。结果显示,rCPA_C3主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30~50个、二免抗血清可中和70~100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%（4/4）死亡,免疫组得到了100%（4/4）的保护。以上结果说明,rCPA_C3具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。