应用real-time RT-PCR监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化

 使用褐色橘蚜在提前7个月预免疫接种了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）弱毒株CT11的锦橙植株上拮抗接种强毒株CT14,应用real-time RT-PCR技术,监测供试植株中CTV强、弱毒株的含量变化,同时采用内参基因18S rRNAF/R及nad5F/R校正检测结果。试验结果表明,在拮抗接种3个月内始终未能在预免疫的拮抗植株中检测出强毒株CT14。在25头蚜虫拮抗接种后45 d和50头蚜虫拮抗接种后10 d,绝大多数预免疫的拮抗植株中弱毒株的含量高于预免疫的负对照植株,此后弱毒株的含量基本下降到负对照植株的水平,而负对照植株内弱毒株的含量变化不明显。     

交叉保护防治柑橘衰退病研究进展

柑橘衰退病毒引起的茎陷点型和速衰型衰退病对世界柑橘产业造成了严重损失。目前交叉保护是防治茎陷点型衰退病最有效的方法,也用于酸橙砧木速衰型衰退病的防治。从各国防治经验、弱毒株筛选方法、防治机理等方面对交叉保护防治柑橘衰退病的最新研究进展作出综述,同时就现有交叉保护防治技术的不足和解决途径进行讨论和展望,旨在为更好地防治柑橘衰退病提供借鉴。     

柑橘衰退病毒研究进展

综合有关文献,就柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)的生物学特征、分子生物学、抗病毒基因工程和柑橘衰退病的检测、鉴定及防治作一综述。重点讨论CTV株系分化、基因组和亚基因组RNA、CTV的血清学和分子生物学检测方法。目前的研究表明,CTV通常以不同株系的混合物存在,并且和其他病原形成复合侵染,各分离物之间存在明显的遗传多样性。不同株系的分离纯化、各株系间的交叉保护及CTV和橘蚜的互作关系还有待深入的研究。     

柑橘衰退病交叉保护研究进展

柑橘衰退病毒（CTV）是世界性的柑橘病毒病害,广泛分布于世界各柑橘产地,对全世界的柑橘产业造成了严重威胁。各国研究人员为防治CTV进行了细致的研究。本文从CTV的分子生物学特征、株系分化、传播途径和弱毒株系交叉保护综述了国内外的科研进展。     

柚新老枝叶中柑橘衰退病毒的DTBIA检测

应用直接组织印迹免疫法(Direct Tissue Blot Immuno-Assay,DTBIA)检测了中国农业科学院柑橘研究所品种资源圃的212株柚植株,呈柑橘衰退病毒阳性的有94株,占样品总量的44.3%.进一步对85株DTBIA阳性柚植株的新老枝叶进行检测,结果初步明确CTV在柚植株中存在不均匀分布现象,其中,新茎的平均CTV检出率最高,为77.9%,其次为新叶的77.1%;老叶和老茎的CTV检出率相对较低,分别为40.5%和38.7%.     

寄主凤凰柚对柑橘衰退病病毒甜橙分离株构成的影响

 为研究不同柑橘类型对柑橘衰退病病毒构成的影响，将9个保存在新会橙上的引起甜橙茎陷点症状的柑橘衰退病毒强毒分离株嫁接接种到凤凰柚后，比较了接种前后p25基因的HinfⅠRFLP 和SSCP变化情况。分离株 CT90与CT20接种前后的RFLP组群没有发生变化；RFLP组群发生变化的分离株中有6个由混合组群变为单一组群。此外，除分离株CT90接种前后的SSCP谱带保持不变外，其余8个分离株从新会橙接种到凤凰柚后，SSCP谱带数均呈减少趋势。试验结果倾向于表明某些能在甜橙上增殖的CTV株系在凤凰柚上的增殖受到了抑制。     

柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及变异的影响

为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）不同基因型的抑制效果,将T36、T30、VT和T3等基因型CTV的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱檬’和‘强徳勒柚’,运用RT-qPCR技术检测被接种植株中CTV复制水平的差异。结果表明,‘墨西哥莱檬’最适于CTV各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中VT、T3和T36基因型的复制水平最低。4种柑橘品种对T36基因型CTV都有明显的抑制作用。通过对CTV的CP基因进行分析发现,VT基因型CTV在‘赛蒙斯’甜橙中发生了较大变异。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

基于p23基因的野生柑橘和栽培柑橘上衰退病毒分离株间的遗传特征分析

【目的】比较分析野生柑橘与栽培柑橘上衰退病毒(CTV)分离株间的分子遗传特征,为深入解析CTV的遗传进化提供相关依据。【方法】运用RT-PCR对我国云南、广西、四川、湖南、江西等省(区)的11个野生柑橘上的CTV分离株和4个国内栽培甜橙及柚上的CTV强弱毒代表株分离株的p23基因进行扩增、测序,所获序列与Gen Bank收录的具有代表性的国外CTV分离株的相应基因序列进行比对分析。【结果】野生柑橘与国内外栽培柑橘上CTV分离株的p23基因序列相似率为87.7%~99.3%;密码子中碱基含量GC%AT%,密码子转换数多于颠换数,第3位的碱基替换数最多,其次为第1位,最少是第2位;非同义突变与同义突变的比值(dN/dS)小于1,表明p23基因在进化过程中承受着净化选择。系统聚类分析表明,来自于野生柑橘上的11个CTV分离株在构建的系统发育树中分属不同的簇支,与不同来源地具有较高相似性和较低遗传距离的栽培柑橘上的CTV分离株构成同一组群。【结论】野生柑橘与栽培柑橘上的CTV分离株在碱基含量、密码子转换和颠换率及非同义突变与同义突变比值(dN/dS)等遗传特征方面均表现出一致性,系统发育分析表明,野生柑橘上CTV分离株基于p23基因序列的聚类关系与其地理来源之间无明显相关性。     

重庆柑橘主产区衰退病毒组群分析

柑橘衰退病毒(CTV)存在严重的株系混合侵染现象,因此需要用一定的方法对混合株系进行识别。本文应用CPGs/HinfⅠ对采自重庆市6个主要柑橘产区的92个CTV阳性样品进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析,结果发现在甜橙上既有单一株系侵染(CPGs/HinfⅠRFLP组群以3为主),也有混合株系侵染(CPGs/HinfⅠRFLP组群以1、3或1、3、6组群为主),而在柚类上只带单一的CPGs/HinfⅠRFLP6组群。     

柑橘黄龙病和衰退病的同步PCR和RT-PCR检测

柑橘黄龙病(HLB)和衰退病(CTV)是2种危害严重的世界性柑橘病害,国内外对其病原检测的研究相当多。研究建立了同时检测HLB和CTV的多重RT-PCR体系,从影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行体系优化。结果表明,多重PCR反应的退火温度应优先考虑退火温度高的引物,退火温度高的引物所需浓度要大于相应退火温度低的引物。该体系实现了DNA病原和RNA病原的统一检测,进一步体现了多重RT-PCR的优越性。     

应用SSCP技术分析我国柑橘衰退病毒的混合感染

以随机采样的方式,从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑(CitrusunshiuMarc.)、橘(C.reticulataBlanco)、甜橙(C.sinensisOsbeck)和柚(C.grandisOsbeck)样品。对PAS-ELISA法初步检测呈阳性的样品进行柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus,CTV)CP基因(coatingproteingene,CPgene)的RT-PCR扩增,结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV,单个采样点的感染率为20.0%～71.4%,而总感染率达49.6%,表明CTV在这些地区广泛发生。单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)分析显示,120份CTV的CP基因RT-PCR的扩增产物共产生120种SSCP带型,而且存在广泛的混合感染。     

柑橘抗CTV转基因与分子标记研究进展

综述了柑橘抗衰退病基因工程中两方面的研究进展。介绍多种来源于柑橘衰退病毒(Citrustriztezavirus,CTV)核酸序列的转基因柑橘和抗性种质资源中抗性基因的分子标记,以及所涉及的方法和遇到的问题。目前研究表明,虽然已成功实现对病毒衣壳蛋白(CP)等基因的转化和Ctv等抗性基因的标记,但尚未获得对CTV有高度抗性的转基因柑橘,而抗性基因亦不能实现定点克隆和转化。因此上述两方面研究还有待深入。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

柑橘衰退病毒侵染对寄主植物同工酶及酸性病程相关蛋白表达的影响

以柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)不同致病力株系接种寄主植物,比较分析了寄主植物体内过氧化物酶(peroxidase,POD)和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性变化特点。结果表明,该病毒侵染对这2种酶活性的影响因寄主品种和CTV株系而异,CTV强毒和弱毒株系侵染均导致墨西哥莱檬植株中POD活性明显降低;在甜橙上,CTV强毒株系接种植株中POD活性则显著性提高,而弱毒株系接种对POD的活性无明显影响;在对该病毒具有较高抗性的枳壳中,接种CTV不同株系对POD活性均无明显影响。而在接种强毒株系N25的墨西哥莱檬中PPO活性有所增强,在枳壳上则表现为接种植株的PPO活性降低,在甜橙上PPO活性无明显的变化。POD、PPO和酯酶(esterase,EST)同工酶酶谱分析的结果显示,CTV弱毒株系接种枳壳后诱导产生了2条新的EST同工酶谱带,而在其他CTV接种植株上均未诱导表达新的POD、PPO及EST酶谱。酸性病程相关蛋白分析结果显示,CTV强毒株系在甜橙上诱导产生有6条明显的酸性病程相关蛋白条带。