桃MYB3基因的克隆及表达分析

本试验以桃抗寒性不同的3个品种毛桃、21世纪、优25-3的叶片、越冬的韧皮和花芽为试验材料,根据NCBI数据库中预测的桃MYB3的mRNA(GenBank登录号为XM007218080.2)序列设计一对引物,通过RT-PCR技术克隆得到一个长度2 268 bp的MYB3基因序列。生物信息学软件分析表明,其含有2个内含子,3个外显子,含有1个完整的开放阅读框长度为1 128bp,编码375个氨基酸,分子质量为41.931 kD,理论等电点为5.10,具有2个典型的SANT结构域,属于R2R3-MYB.遗传进化分析表明PpMYB3与乌梅(Prunus mume)的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,PpMYB3在桃的花芽和韧皮部均有表达,PpMYB3相对表达量与取材时期温度变化趋势相一致。本试验推测PpMYB3转录因子在桃抗寒方面起到负调节作用。     

杜梨2个MYB转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)MYB家族的2个基因(Pb3RMYB和Pb4RMYB),分析其序列特征,为研究其调控的分子机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆杜梨Pb3RMYB和Pb4RMYB的c DNA序列全长;利用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、TMHMM、Signal P、Plant-m Ploc、SPOMA、DANMAN、MEGA6等软件对氨基酸序列进行分析。【结果】克隆得到Pb3RMYB和Pb4RMYB基因全长,Gen Bank登录号分别为KX272614和KX272615。2者均含有MYB保守结构域,二级结构均以无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-折叠为主,亚细胞定位分析表明2者均定位于细胞核中。其中,Pb3RMYB属于3R-MYB亚家族,全长2 355 bp,ORF长1 710bp,编码569个氨基酸,蛋白分子质量约为62 077.3 Da,等电点为7.08;BLAST分析表明Pb3RMYB与已报道的其他物种3RMYB具有较高的相似度。Pb4RMYB属于4R-MYB亚家族,全长3 625 bp,ORF长2 913 bp,编码970个氨基酸,蛋白分子质量约为109 600.6 Da,等电点为7.41。【结论】获得了2个杜梨MYB基因Pb3RMYB和Pb4RMYB,分别属于3RMYB和4R-MYB亚家族。     

香菇血红素过氧化物酶基因克隆及表达分析

对香菇(Lentinula edodes)血红素过氧化物酶(heme peroxidase,LeHP)基因进行鉴定、生物信息学分析和克隆,并通过荧定量PCR研究各LeHP基因在香菇采后贮藏期间的表达情况.结果表明:香菇中含有3个LeHP基因,编码序列长度为3165～3240 bp,编码1055～1089个氨基酸;所有L...     

猕猴桃MYB家族成员鉴定及其低温表达分析

通过对‘红阳’猕猴桃基因组鉴定得到277个MYB家族成员并将其分为12个亚家族（S1～S12）,其中多数序列属于R2R3-MYB,其次是MYB相关蛋白,仅鉴定到1个4R-MYB。S11和S12亚家族在进化上处于较早的位置,结构较为多样化,而S1和S2在进化上出现较晚。顺式作用元件分析显示,该家族主要含水杨酸、赤霉素和茉莉酸甲酯等相关植物激素元件,还有部分参与昼夜节律、低温、细胞周期等相关元件。密码子偏好性分析显示,猕猴桃MYB家族有3个高频密码子（UUG、AGA和AGG）,基因的密码子偏好使用A/T,第3位碱基偏好更强。通过顺式作用元件分析和4个猕猴桃品种越冬期转录组数据分析筛选了9个可能参与低温胁迫响应MYB基因,对其在低温胁迫下的软枣猕猴桃‘龙成2号’中进行检测验证,确认这些基因参与猕猴桃对低温的响应。     

香蕉抗逆相关基因MaERF的克隆与表达分析

 根据已获得的AP2/ERF基因片段,通过RACE方法获得一个香蕉ERF基因完整编码区序列,命名为MaERF。该基因cDNA全长1 611 bp,其中开放阅读框1 128 bp,编码376个氨基酸,包含一个保守的AP2/ERF结构域,基因组序列全长2 881 bp,含有一个内含子,剪切位点符合“GT-AG”规则;系统进化树表明该基因属于植物ERF转录因子家族的B2亚群。半定量RT-PCR分析表明,该基因在香蕉各个器官中均有表达,其中在根和叶中的表达量较低,而在果实和花中的表达较高;实时荧光定量Real-time PCR检测表明,受尖孢镰刀菌侵染及低温胁迫后,香蕉中该基因表达明显上调,推测其在香蕉胁迫反应中可能发挥重要作用。     

金线莲ArLBD1基因克隆、亚细胞定位及表达分析

以金线莲(Anoectochilus roxburghii)叶片的转录组数据为基础,采用RT-PCR技术克隆到了金线莲ArLBD1转录因子基因,采用生物信息学、原核表达、Western blot、亚细胞定位及qPCR等方法对该基因功能进行初步分析,以期为进一步研究其功能提供参考依据。结果表明：ArLBD1基因CDS长度864 bp,编码287个氨基酸。ArLBD1蛋白分子量为30.62 kD,理论等电点为6.25,不稳定系数55.55,属于不稳定蛋白。ArLBD1蛋白含有LOB superfamily保守结构域,第7～28氨基酸为C基序,第36～84氨基酸为GAS基序,第89～107氨基酸为类亮氨酸拉链基序,具有完整的类亮氨酸拉链基序,属于ClassⅠ。系统进化分析表明ArLBD1与拟南芥AtLBD36的亲缘关系最近,其次是AtLBD6。SDS-PAGE电泳及Western blot结果显示,ArLBD1基因在大肠杆菌中成功诱导表达。亚细胞定位分析发现ArLBD1蛋白定位在细胞核。qPCR分析结果表明,ArLBD1基因在金线莲叶、茎和根中都能检测到表达,在叶片表达量最高,其次是根,茎的...     

香蕉果实MaGBSSI基因家族的克隆及表达分析

以"巴西"蕉(Musa acuminata L.AAA group cv.Brazilian)为试材,利用同源克隆法获得4个颗粒结合淀粉合成酶I(Granule-Bound Starch Synthase I,GBSSI)基因家族成员的cDNA全长,运用MEGA 5.05软件进行聚类分析,并通过quantitative real-time PCR(qPCR)技术检测MaGBSSI基因家族成员在香蕉果实不同发育时期及成熟阶段和不同组织中的表达情况。结果表明:香蕉4个MaGBSSI基因家族成员MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-3、MaGBSSI-4的cDNA全长分别为1 851、1 851、675、1 845bp,登录号分别为KF512020、KF512021、KF512022、KF512023。聚类分析发现,香蕉MaGBSSI基因家族与其它植物GBSSI基因同源性达65%。qPCR分析发现,MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-4在香蕉根、球茎、叶片和苞片等营养器官中明显上调表达,而MaGBSSI-3在花、果皮、果肉等生殖器官中表达量比较高,在根、球茎及叶片中几乎不表达。香蕉果实发育过程中,MaGBSSI-1、MaGBSSI-2、MaGBSSI-4在0~30d明显上调表达,而MaGBSSI-3在香蕉果实发育30~60d表达量比较高,在0~30d几乎不表达,且随着果实的成熟,MaGBSSI-3表达量逐渐下降。研究结果为阐明香蕉果实的直链淀粉生物合成及降解机制并对其进行表达调控奠定了基础。     

草莓CO基因克隆与表达分析

采用RT—PCR和RACE技术从短日照草莓品种‘卡姆罗莎’（Fragaria×ananassa Duch．CV．‘Cama-rosa’）嫩叶中克隆得到与草莓成花相关的基因,命名为FaCO（GenBank登录号,FJ377616）。     

枇杷果实DHN基因克隆及其在低温胁迫下的表达分析

 以白沙枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）‘宁海白’幼果为试材,通过RT-PCR与RACE扩增,获得两个具有脱水素基因典型结构域特征的cDNA序列。其中DHN1（GenBank登录号：FJ472835）全长639 bp,编码188个氨基酸,属于Y2SK3类型;DHN2（GenBank登录号：FJ472836）全长858 bp,编码273个氨基酸,属于SK3类型。用低温胁迫处理枇杷幼果,–3 ℃处理24 h后电导率明显升高,表明细胞膜开始受到破坏,–6 ℃处理24 h后电导率显著高于–3 ℃处理。半定量RT-PCR和Western-blotting分析结果表明这两个DHN基因在低温胁迫下的枇杷幼果中都上调表达,表明其与枇杷抗低温胁迫有一定关系。     

7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1 like homeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料,分离了多个苹果（Malus domestica）KONX基因,研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明,获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22(GenBank登录号：MG021644～MG021650)。结构域分析表明,获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK结构域。进化分析表明,MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组;MdKNOX10、MdKNOX13、Md...     

香蕉不同器官中microRNA差异表达分析

【目的】研究mi RNA在香蕉不同器官中的表达,初步探索mi RNA在香蕉生长发育过程中的可能作用。【方法】利用茎环引物的半定量和实时荧光定量PCR策略,检测香蕉中的保守mi RNA,并进一步研究mi RNA在香蕉根系、叶片、雄花和果实组织中的表达差异。【结果】mi RNA156d和mi RNA162a具有相似的表达模式,其最高表达量均出现在雄花组织中。mi R156d在雄花中的表达量(2.25)明显高于根系(0.17)、果实(0.34)和叶片(1.00);mi R162a在雄花中的表达量最高,为4.36,根系组织次之,为1.72,而在叶(1.00)和果实(0.99)中的表达几乎相同。mi R164e在根系中的表达量最高,为2.37,雄花次之,为1.93,而在叶(1.00)和果实(0.98)中表达几乎相同。mi R169h在4种组织中的表达量差异不明显。【结论】以香蕉各组织总RNA为模板,通过以SYBR Green为染料的Stem-loop q RT-PCR方法,成功地在香蕉根系、叶片、雄花和果实4种器官中均检测到了保守mi RNA的表达,表明本研究所建立的体系是定性或定量检测香蕉植株中保守mi RNA的准确而有效的方法。同时,在香蕉的不同组织中发现了具有显著表达差异的mi RNA,符合mi RNA在不同组织的表达活性具有多样性的规律。     

石榴花器官发育相关基因PgWUS和PgBEL1克隆及其时空表达分析

在前期构建的'泰山红'石榴(Punica granatum L.)基因组数据库的基础上,鉴定并采用同源克隆技术克隆得到PgWUS和PgBEL1全长CDS (Coding sequence)序列.PgBEL1编码区全长为1851bp,PgWUS为936 bp,分别编码616个和311个氨基酸.蛋白序列比对及系统进化分析发...     

枸杞MYB103转录因子的生物信息学分析

利用生物信息学方法对枸杞MYB103基因编码蛋白的理化性质、亲水性/疏水性、信号肽、跨膜结构域、二级结构、三级结构、结构域和功能分类等方面进行了预测和分析。结果表明:该蛋白属于不具有信号肽的亲水性蛋白,α?螺旋和无规则卷曲是蛋白质二级结构最大量的结构元件,并散布于整个蛋白;且含有2个典型MYB保守结构域,符合R2R3-MYB亚家族保守结构域的特点,这一结果可为植物MYB103的结构与功能及利用研究提供进一步的信息参考。     

炭疽菌诱导的枇杷病程相关基因EjPR1的克隆及其表达分析

以炭疽病病原菌(Colletotrichum gloeosporioides)处理的枇杷高抗品种'Peluches'的叶片为材料,利用RT-PCR和RACE克隆技术,获得枇杷病程相关蛋白1基因的cDNA全长序列,命名为EjPR1.该基因全长为731bp(GenBank登录号为MN92775),5'端非编码区79bp,3...     

香蕉凝集素基因双启动子表达

为了获得香蕉果实特异表达的强启动子,利用PCR方法将2个凝集素(BanLec)基因启动子串联在一起,置换植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建BanLec基因双启动子携带gus植物表达载体pBIL3,用基因枪转化香蕉叶片、根系和果实薄片,瞬时表达结果显示BanLec基因串连的双启动子依然表现为果实特异性表达,而且表达量明显高于BanLec基因单启动子及35S启动子,证明该串连的双启动子是一个在香蕉果实中特异表达且表达量较高的强启动子。     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

牡丹病程相关蛋白1基因的克隆及表达分析

 以牡丹柱枝孢叶斑病病原菌Cylindrocladium canadense处理的牡丹‘鲁菏红’叶片为材料,根据已发表植物PR1的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得病程相关蛋白1基因的cDNA,命名为PsPR1。该序列全长为744 bp,5′和3′非翻译区分别有42 bp和225 bp。该基因有477 bp的开放阅读框（ORF）,编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量14.8 kD,等电点（pI）6.19,具有典型的SCP_PR1_like保守结构域。通过Blast比对发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性。通过实时荧光定量PCR检测,发现该基因在牡丹萼片中相对表达量最高,在正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质SA的显著诱导,分别在处理的24 h和12 h达到最高峰,说明PsPR1可能参与了牡丹的抗病防御过程。     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

转录组分析超表达MpICE1香蕉抗枯萎病机理

前期研究发现在香蕉中超表达大蕉(Musa spp. ‘Lingchuan Dajiao’)MpICE1能显著提高香蕉抗枯萎病能力,为进一步揭示其分子机理,通过转录组对接种Foc TR4前0 d和接种后7、14 d的野生型和超表达MpICE1香蕉(Musa spp. ‘Brazil’)的根部中差异表达基因进行分析。结果表明,在接种前超表达MpICE1香蕉可诱导一系列基因的高表达,且这些高表达的基因富集在苯丙烷合成、黄酮合成、ABC转运蛋白、MAPK信号传导和戊糖、葡萄糖醛酸转换等途径中,与细胞壁结构和功能相关。MpICE1的超表达可能会增强香蕉的基础免疫反应,从而对Foc TR4的抗性增强。另外,接种Foc TR4后,超表达MpICE1香蕉接种前0 d高表达的大部分基因表达量开始下降,到7 d时达到相对稳定的状态。对差异表达基因进一步分析发现,编码12–氧–植物二烯酸还原酶的基因(Ma06＿g18840)可能是MpICE1的靶基因,且其表达量受MpICE1的抑制,与氧化脂质(JA和OPDA)代谢相关,可能通过JA或OPDA信号途径调节根部细胞壁结构。泛素碳端水解酶(Ubiquitin c...     

香蕉条斑病毒ORF Ⅰ基因克隆及编码蛋白和同源物的生物信息学分析

【目的】探明杆状DNA病毒属病毒的ORFⅠ基因功能。【方法】本研究从香蕉条斑病毒云南分离株(BSV-YN)中克隆了BSV ORFⅠ基因,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN的分类地位;对其编码蛋白及同源物的理化性质、氨基酸序列组成、亲疏水性、跨膜区域、信号肽、亚细胞定位、磷酸化位点、同源结构域、蛋白二级和三级结构等进行预测和分析。【结果】BSV ORFⅠ基因片段大小为528 bp,编码175个氨基酸,通过核苷酸和氨基酸序列分析和同源关系分析,确定了BSV-YN属于BSGFV种。生物信息学分析表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白都是不稳定的、亲水性蛋白,以丝氨酸和苏氨酸磷酸化为主。这些蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,无信号肽或跨膜区域。亚细胞定位预测表明,BSV-YN ORFⅠ及同源蛋白主要在细胞核分布,推测它们在病毒感染的宿主细胞核中发挥重要作用。【结论】推测BSV-YN ORFⅠ在病毒感染的宿主细胞核中参与病毒复制、转录等相关过程。本研究为进一步开展该蛋白的功能研究提供科学线索。