‘小白杏’自交不亲和SFB基因RNAi表达载体的构建

【目的】应用RNA干扰(RNAi)技术在分子水平调控杏自交不亲和性状,为培育自交亲和杏品种奠定基础。【方法】基于南疆自交不亲和杏品种‘小白杏’(Prunus armeniaca‘Xiaobaixing’)花粉决定子SFB(S-haplotype-specific Fbox protein)基因3’端c DNA全长序列,选取SFB基因变异区上游距起始密码子61 bp处、大小为29 bp的片段作为干扰序列,棉花基因组DNA 242 bp的序列作为间隔片段,利用融合PCR(Fusion PCR)构建SFB基因发卡结构(intron-containing hairpin RNA,ihp RNA),再酶切连接到植物表达载体p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII上,构建SFB基因RNAi表达载体;用冻融转化法将重组质粒转化至农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中。【结果】测序结果表明臂长29 bp、茎环242 bp的SFB基因ihp RNA结构融合成功,双酶切检验和PCR验证结果表明,该结构正确地插入p CAMBIA-35S-MCS-NOS-NPTII的启动子和终止子之间,说明SFB基因的RNAi表达载体p CAMBIA-RNAi-SFB构建成功;PCR验证和测序结果也表明重组质粒已经成功转入农杆菌LBA4404中。【结论】研究结果表明,应用融合PCR结合酶切连接的方法构建SFB基因的RNAi表达载体是可行的,为RNAi技术在果树自交不亲和性状改良上的应用创造了条件。     

新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因的检测

 为系统鉴定新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因型,以新疆25个主栽杏品种为试材,利用蔷薇科保守序列设计引物对叶片基因组DNA进行SFB基因特异PCR扩增,筛选出有效的扩增引物;对成功扩增的杏品种的特异条带克隆测序,在GenBank上进行BLASTN比对,确定各品种的SFB基因型。结果显示：引物组合Ⅱ-1、Ⅳ-2,1-Ⅰ、1-Ⅱ对新疆杏品种的扩增效果最好,成功地在18个品种上扩增出了5种大小不同的条带,14种不同的基因型,其中两     

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。     

中国杏自交不亲和花粉特异SFB基因的鉴定与序列分析

利用花粉SFB基因的同源扩增结合内切酶酶切的方法,在9个中国杏品种中首次克隆了6个花粉SFB基因,对应花柱S-RNase基因序号将其分别命名为Par-SFB8、Par-SFB9、Par-SFB11、Par-SFB17、Par-SFB23和Par-SFB26,在GenBank上的登录号分别为EU652883、EU935588、EU652884、EU652885、EU652886和EU652887。序列分析表明杏的花粉SFB基因具有蔷薇科李属植物SFB基因的典型结构特征;其内含子位于5′端非翻译区,长度90 ~ 108 bp,核苷酸序列的同源性为63.9% ~ 93.3%。氨基酸序列的同源性比较表明,杏花粉SFB基因的种内同源性为73.7% ~ 85.3%;与李属其他植物花粉SFB基因的种间同源性为75.2% ~ 97.7%。利用特异PCR扩增进一步确定了杏的S9、S11、S17和S26单元型花柱S-RNase与花粉SFB基因间距离,表明花柱S-RNase与花粉SFB基因紧密连锁;同时组织特异性表达分析确定SFB基因在花粉组织中特异表达。以上结果说明获得的SFB基因为杏的花粉候选S基因。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

杏的自交不亲和机制研究进展

被子植物的自交不亲和有孢子体型不亲和与配子体型不亲和两种类型,杏的自交不亲和属于配子体型不亲和。从生物学、细胞学和分子学角度综述杏的自交不亲和机制,对比分析研究自交亲和品种和自交不亲和品种不同的受精过程及杏的开花生物学和授粉生物学特性,为生产上花期管理、合理选配授粉树提供依据,为杏种质资源、遗传育种及生物技术等方面研究提供参考。     

果树自交不亲和SFB与S-RNase作用分子机制研究进展

综述了蔷薇科果树自交不亲和性分子机制的相关研究进展,对果树自交不亲和关键基因SFB与S-RNase的生物合成与表达,序列结构特点及对应功能、作用机理及其在花柱传输组织中的相互作用等方面进行了总结,并在此基础上提出了改进修正抑制子假说的相互作用机理,以期为开展果树自交不亲和分子机制的深入研究提供基础资料。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

甜樱桃‘拉宾斯’自交亲和性与SFB4′基因的关系研究

甜樱桃品种‘拉宾斯’与‘雷尼’均为S1S4基因型。调查其自花结实率,‘拉宾斯’为31.3%,表现自交亲和;‘雷尼’为0,表现为自交不亲和。将‘拉宾斯’与‘雷尼’相互授粉,‘拉宾斯’为父本时表现亲和,反之不亲和,推断‘拉宾斯’的自交亲和性由花粉侧突变导致;调查花粉萌发率,‘拉宾斯’为58.08%,‘雷尼’为57.82%。鉴定‘拉宾斯’自交后代及其与‘雷尼’杂交后代的S-RNase的基因型,发现所有后代中均出现S4基因型,部分后代中出现S1基因型,证明‘拉宾斯’花粉育性是正常的,其亲和性可能是由S4基因座上花粉侧的基因突变导致。测序发现‘拉宾斯’花粉SFB4′在911 bp处有4个碱基缺失。分析‘拉宾斯’花粉SFB4′与花柱S4-RNase的连锁性,发现两者连锁率为100%。以‘拉宾斯’为父本的带有SFB4′的杂交后代的自花结实率为23.3%~61.4%,表现自交亲和,说明来源于‘拉宾斯’的SFB4′基因与自交亲和性有关。RT-PCR及测序显示‘雷尼’SFB4与‘拉宾斯’SFB4′均能正常转录,但4个碱基缺失导致其C端翻译提前终止,原核表达SFB4和SFB4′蛋白发现SFB4略大于SFB4′,推测是由于SFB4′的翻译提前终止导致的。以上结果表明:‘拉宾斯’的自交亲和性可能是由花粉侧SFB4′C端的氨基酸缺失导致,该缺失可能使其丧失了与S-RNase的识别能力。     

20个中国李品种自交不亲和S-RNase基因型的鉴定

利用蔷薇科S-RNase通用引物Pru-C2/PruCE-R以及12对特异性引物,对贵州省栽培的20个中国李(Prunus salicina Lindl.)品种叶片DNA进行PCR扩增,鉴定其S基因型。结果表明：采用S-RNase通用引物,仅11个李品种扩增出2个条带;采用12对S-RNase特异性引物,既扩增出与通用引物一样的结果,又鉴定出2个品种的S基因型。共鉴定了13个中国李品种完整的S基因型：红心李S_hS₁₀,姜黄李S₁₀S₂₀,南方李S_iS₉,柰李S_hS_f,槜李S_hS₇,幸运S_bS_c,芙蓉李S_bS_i,大红袍S_dS₂₀,前卫红S_eS_h,玫瑰皇后、澳得罗达、黑宝石和秋姬李S_b     

杏(Prunus armeniaca)自交不亲和强度及其授粉受精相关特性

为了解杏自交不亲和性强度与授粉受精相关特性的关系,以自交亲和(Self-compatibility:SC)品种凯特(Prunus armeniaca L．cv．Katy)和自交不亲和(Self-incompatibility:SI)品种新世纪(P.armeniaca L.cv．Xinshiji)及凯特×新世纪杂种群体为试材,荧光显微镜观察自交亲和与自交不亲和杏花粉管生长动态。结果表明,授粉后初期,自交亲和性与自交不亲和性的杏花粉都能正常萌发、生长,但是在花粉管生长延伸到花柱1／2以后,自交亲和性的花粉管能顺利进入子房,而自交不亲和性的花粉管多数顶端膨大呈球形,停止向下生长,只有极个别能正常生长到达子房;杂种后代的可溶性蛋白含量和RNA酶比活力,与亲本相比无明显的趋中变异表现,而且在自交亲和与自交不亲和杏之间无显著性差异。     

胚培杏新品种‘山农凯新2号’

 ‘山农凯新2号’是以果大、仁甜、抗病、品质优的国产‘泰安水杏’为母本, 以引进的、自交亲和的‘凯特’杏为父本进行有性杂交, 结合胚培技术育成的新品种, 具有果实大、品质优、自交坐果率高、丰产性强等特点。     

果树自交不亲和花粉S基因研究进展

果树自交不亲和属于配子体自交不亲和,配子体自交不亲和至少由S位点的花柱S基因和花粉S基因2个基因决定,花柱S基因已被确定为S-RNase基因,而花粉S基因研究在近年才取得进展,一个在花粉中特异表达的基因SFB(Shaplotype-specificF-boxprotein)被发现,并且多方面的证据表明该基因是花粉S基因的最佳代表。就花粉S基因的筛选、该基因的结构特点、可能的作用机理等方面的研究进展予以综述。     

扁桃自交不亲和基因的多态性分析

 根据蔷薇科树种S基因的保守序列设计引物, 利用PCR技术对8个新疆扁桃品种S基因进行扩增, 获得了10个大小不同的S基因片段。测序结果表明, 这些DNA片段的核苷酸序列中都具有编码蔷薇科S-RNAase 5个高度保守区域: C1、C2、C3、RC4、C5的序列、编码高变区(RHV) 的序列以及变异度很大的内含子序列, 并且其高变区和内含子序列具有扁桃S基因特异性。同源性分析表明, 获得的10个氨基酸序列与蔷薇科中李亚科S2RNase的氨基酸序列同源性达67% ～96% , 扁桃与樱桃、杏应同属于李亚科。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

桃自交亲和性的分子机制及遗传特性研究

 以油桃（Prunus persicavar.necturina）‘中油5号’及其自交后代为试材,利用花柱S-RNase基因和花粉SFB基因的特异性引物进行PCR扩增,对扩增片段进行回收、克隆、测序和Blast分析,确定了‘中油5号’的自交不亲和基因型为S₁S_2(m)。序列分析结果显示,‘中油5号’桃S₁-RNase和S_2(m)-RNase与多个其他李属S-RNase基因氨基酸和核苷酸序列间都具有极高的相似性,SFB₁和SFB₂基因与多个其他李属SFB基因氨基酸和核苷酸序列间也都具有极高的相似性。进一步对‘中油5号’自交后代个体的S基因型进行检测,发现后代群体中存在3种S基因型,分别为S₁S₁、S₁S_2(m)和S_2(m)S_2(m),且分离比为8︰13︰7,与预期的比例1︰2︰1差异不显著（χ² = 0.214 < χ²_0.05,2 = 5.991）,说明S-RNase基因和SFB基因都遵循两因素的孟德尔遗传规律进行连锁分离。此外,基因型为S₁S₁和S_2(m)S_2(m)的纯合体的存在,表明桃花粉SFB₁和SFB₂基因均不能被自身花柱S-RNase所识别,这是由于SFB₁和SFB₂基因翻译提前终止所造成的,从而使‘中油5号’表现出自交亲和性。     

‘鸭梨’及其自交亲和性突变体‘金坠梨’花粉蛋白质组比较分析

【目的】分析‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉蛋白差异,探讨‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变的机制。【方法】以‘鸭梨’及其自交亲和性芽变‘金坠梨’花粉为材料,利用双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis,2-DE)对二者花粉总蛋白进行分离,并对差异蛋白进行功能和质谱分析,通过qRT-PCR进行相关差异基因的表达验证。【结果】分离得到23个差异蛋白,其中14个蛋白在‘金坠梨’中上调表达,9个蛋白在‘金坠梨’下调表达;对其中差异显著的10个蛋白点质谱检测结果表明,1个为半胱氨酸甲基转移酶(cysteine S-methyltransferase,4 803),1个为存储蛋白(Storage protein,5413),4个为蛋白酶类:果糖激酶(fructokinase,5 316)、顺乌头酸水合酶(aconitate hydratase,5 811)、烯酰-ACP-还原酶(Enoyl-ACP reductase,7 303)和JPR ORF1蛋白(JPR ORF1 protein,7 506),4个为HSP家族蛋白:HSP70伴侣26(HSP70-type chaperone 26,8 633)、HSP 90.5(8 822)和2个ER结合蛋白(ER-binding protein,4 209和8 805)。这些蛋白涉及到遗传信息处理、碳水化合物代谢、能量代谢、酶和氨基酸代谢等生理过程;qRT-PCR对8个基因进行验证,发现部分基因在蛋白水平与基因表达水平有明显差异。这些差异的蛋白在不同的信号途径中参与了‘金坠梨’花粉侧自交亲和突变。【结论】明确了‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉侧自交亲和性突变中差异表达蛋白,为进一步研究梨亚科自交不亲和性的调控机理提供理论依据。     

香石竹ACC氧化酶基因的克隆及其正义反义表达载体的构建

利用在Genebank上已报道的香石竹ACC氧化酶(ACO)基因的CDNA序列设计特异引物,以香石竹品种'MASTER'的eDNA为模板进行PCR扩增,克隆香石竹ACC氧化酶(AC0)基因.测序结果显示,克隆基因的序列与报道序列完全一致.将克隆的ACC氧化酶(AC0)基因分别连接到植物表达载体PBI121启动子CaMV 35S的上游及下游,构建香石竹ACC氧化酶(Aco)基因的正义表达栽体PBI121-ACO及反义表达载体PBI121-anti ACO.经PCR鉴定,基因已成功构建到表达裁体上.为香石竹抗衰老基因工程育种奠定了基础.