水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal(AB002266)的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

采用Trizol法提取文心兰花期花葶总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了文心兰GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因的2个部分序列,长度均为875 bp,编码291个氨基酸残基.序列分析结果表明,与其它已登录物种的GAPDH基因相比,其核苷酸序列的同源性均在79％以上,与蕙兰(JN177724.1)同源性高达到92％,氨基酸序列的同源性也在85％以上;且与单子叶植物的同源序列表现出较高的相似性.本研究已克隆出文心兰GAPDH基因的部分cDNA同源序列片段,分别命名为OnGA1和OnGA2,并在GenBank注册,登录号分别为JN981141和JN981142.     

日本百脉根γ-生育酚甲基转移酶基因的电子克隆及进化分析

根据物种间同源基因相对保守的特点,利用生物信息学方法,以拟南芥-γ生育酚甲基转移酶cDNA序列为信息探针,在GenBank的HTGs数据库中找到与之高度同源的日本百脉根基因组DNA序列——LjT44D21克隆。通过GENSCAN分析及序列拼接得到日本百脉根"γTMT基因的cDNA序列,GenBank的登陆号为DQ013360。用该序列对GenBank中的est-others进行相似性搜索,获得了44条日本百脉根的EST序列,经拼接后发现与基因组预测的基因序列一致,表明该基因是真实存在和表达的。该cDNA序列长为1 077 bp,具有完整的开放阅读框架(1～1 077 bp)。推测编码蛋白为358个氨基酸,该蛋白序列与大豆、水稻、小麦、拟南芥、油菜、苜蓿和衣藻等物种的-γTMT蛋白质序列进行了同源性比较分析,具有很高的同源性。     

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS（Nucleotide binding site）类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型（R）,其相对抗性指数在0.63-0.82;有5个优系为中抗类型（M）,相对抗性指数在0.27-0.56;有10个为感病类型（S）,相对抗性指数在0.00-0.21。PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它15个优系（5个中抗优系和10个感病优系）中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%-100%同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%-99%,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%-66%。氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区,有较高保守性。系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00-0.95,为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%-63.5%,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%-48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择。     

互花米草中NHX基因片段的克隆与序列分析

利用同源克隆方法从盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）中分离并克隆出Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因的1段cDNA片段,长度为951 bp,推测编码317个氨基酸。氨基酸序列的对位排列分析显示,该cDNA片段对应的氨基酸序列与已知的植物液泡膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白的氨基酸序列有较高的相似性,且与禾本科植物中的同源物之间的关系更为密切。     

十字花科植物HSP22基因同源序列的克隆与进化分析

采用PCR克隆技术,根据已报道的拟南芥的AtHSP22基因全长及其他物种同源序列设计特异引物,在十字花科植物大白菜、普通白菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜、花椰菜、芥菜、荠菜、萝卜3个属10个物种中成功克隆得到耐热相关基因HSP22的同源序列10条。序列比对分析表明:这些同源序列的相似性达89.3%以上,所推导的氨基酸序列相似性达92.1%以上。由进化树可直观地看出,芸薹属与荠属亲缘关系最近,首先聚为一类;其次与萝卜属、拟南芥属聚为一类。由氨基酸序列预测的高级结构存在明显差异,且无规则卷曲最多,α-螺旋均在30%以上,因而属于α结构蛋白。     

转铁蛋白及其同源类似物cDNA序列比较分析

应用NCBI数据库和计算机分析软件对农业部淡水鱼类种质资源与生物技术重点开放实验室克隆的鲫鱼(Carassius auratus)转铁蛋白的cDNA序列以及GenBank序列数据库中的27种转铁蛋白及其同源类似物cDNA序列的同源性进行了比较.结果表明:不同种属和来源的转铁蛋白cDNA的同源性均在30%以上;物种分化时间越早,其转铁蛋白基因的同源性越低,相反则越高;不同种属和不同来源转铁蛋白cDNA的进化并不同步,而是由不同途径分别进化的.根据同源性比较结果绘制出它们的系统发育进化树.转铁蛋白基因的进化顺序推测是:微生物转铁蛋白类似物基因、昆虫转铁蛋白基因、黑素转铁蛋白基因、卵转铁蛋白基因、乳转铁蛋白基因、鸟类血清转铁蛋白基因、鱼类血清转铁蛋白基因、哺乳类血清转铁蛋白基因.对cDNA序列的密码子使用频率和密码子使用偏性进行分析,结果表明:密码子使用频率越高或使用偏性越小,说明该密码子编码的氨基酸对蛋白质空间结构的形成和基本生理功能的影响也越重要;在进化上分化时间越早的物种,密码子使用频率和使用偏性的差异较小,反之则较大;在同源性方面,在进化上比较接近的物种,基因的密码子使用频率和使用偏性指标比较接近或基本相同.     

Sf9细胞存在Dm0-like核纤层蛋白的证据

为了确定Sf9细胞是否存在核纤层(lamina)及其性状,该文首先用已知的昆虫的核纤层蛋白(Lamin)的基因序列在Spodobase数据库搜索Sf9细胞的同源序列,并将推导的氨基酸序列与其他物种的同源蛋白进行比对。再利用抗果蝇Lamin Dm0抗体ADL67通过免疫印迹法(Western blotting)对Sf9细胞的蛋白裂解物进行检测,并通过免疫荧光技术(immunofluore-scence)对Sf9细胞进行染色。在Spodobase数据库搜索到1条Sf9细胞的Dm0-like lamin EST序列,同源比对显示它与其他物种的Lamin存在一定的同源性,尤其与家蚕、果蝇的同源性相对较高。免疫印迹结果表明Sf9细胞裂解物中存在大小约为70ku的蛋白,免疫荧光检测表明Sf9细胞核周呈现阳性反应,这些特征与已知的其他物种的核纤层的性状相似。结果表明,Sf9细胞可能存在Dm0-like核纤层蛋白,可作为探讨杆状病毒核衣壳穿过核纤层的机制之依据.     

蓝莓鲨烯合酶基因的克隆与表达分析

鲨烯合酶基因(SQS)在植物三萜类化合物合成途径中起着重要作用,是上游代谢通路中的关键基因。本研究采用RT-PCR技术从‘喜来’蓝莓根中克隆得到VcSQS基因,序列全长1 489 bp,序列分析结果表明,其含有1 242 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸。氨基酸同源序列分析表明,蓝莓与其它物种SQS蛋白氨基酸序列相似性很高,与山茶科的茶相似性最高,达90.58%,与葡萄相似性达87.92%。荧光定量试验结果表明,SQS基因在蓝莓叶中的表达量最高,芽中的最低。     

蜜蜂(Apis mellfiera)腺苷酸转移载体基因cDNA的电子克隆

以果蝇腺苷酸转移载体基因cDNA序列为信息探针,对蜜蜂EST数据库进行同源检索筛选,克隆了蜜蜂腺苷酸转移载体基因(Am ant)的cDNA序列(GenBank登记号为AY332626),该基因全长1 251bp.经RT-PCR克隆、序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致;该基因具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为300个氨基酸,通过对人、果蝇、家蚕及烟草天蛾的腺苷酸转移载体蛋白序列比较,发现该基因具有高度的保守性;说明根据物种间同源基因序列,进行跨物种EST数据库的同源检索筛选、拼接,是基因克隆的一条有效途径.     

盐生杜氏藻D.salina和D.bardwil苹果酸脱氢酶基因的克隆和序列分析

[目的]探讨利用盐生杜氏藻的MDH基因提高农作物耐盐性能的可行性。[方法]对盐生杜氏藻2个种(D.salina和D.bardwil)的苹果酸脱氢酶(MDH)进行克隆,并对它们的序列进行比较分析。[结果]盐生杜氏藻2个藻种MDH基因的全编码区序列分别长1 303 bp和1 288 bp,分别编码434和429个氨基酸的2个蛋白,经过亚细胞定位预测和相似性搜索,认为这两个蛋白应定位于叶绿体,即属于叶绿体型苹果酸脱氢酶。两个藻种的MDH基因编码区的核酸序列相似性为88.6%,氨基酸序列的相似性为93.5%,去除预测的信号肽序列后两者氨基酸的相似性达到97.4%。经过分子建模分析发现,D.salina的MDH相对于D.bardwil的MDH,大部分的氨基酸突变都位于蛋白分子表面,而且大多数位于分子表面的突变都是非极性氨基酸和极性氨基酸之间的转变。[结论]推测这些蛋白分子表面氨基酸残基的突变可能是D.salina的MDH对高盐浓度环境的适应结果。     

A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure

The inverse protein folding problem, the problem of finding which amino acid sequences fold into a known three-dimensional (3D) structure, can be effectively attacked by finding sequences that are most compatible with the environments of the residues in the 3D structure. The environments are described by: (i) the area of the residue buried in the protein and inaccessible to solvent; (ii) the fraction of side-chain area that is covered by polar atoms (O and N); and (iii) the local secondary structure. Examples of this 3D profile method are presented for four families of proteins: the globins, cyclic AMP (adenosine 3',5'-monophosphate) receptor-like proteins, the periplasmic binding proteins, and the actins. This method is able to detect the structural similarity of the actins and 70- kilodalton heat shock proteins, even though these protein families share no detectable sequence similarity.     

十字花科植物17个物种PIN3基因的系统进化分析

为了探明十字花科植物不同物种PIN3基因之间的进化差异,运用Brassica Database数据库及十字花科基因数据库在线平台,对拟南芥(Arabidopsis thaliala)、红花荠菜(Capsella rubella)、芜青(Brassica rapa)、油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)等17个已完成基因组测序的十字花科物种的18个(油菜含有2个)PIN3同源性基因进行分析,并对其推导的编码蛋白(PIN3)进行了系统进化分析。结果表明,18个PIN3序列间的相似性为86.74%,PIN3推导蛋白之间的相似度为90.93%,蛋白等电点约为7.15~9.44,芜青PIN3等电点明显偏高。PIN3的氨基酸比对分析结果表明,在多个糖基化位点出现具有种属差异性和符合进化关系的氨基酸替换现象,盐芥属植物中条叶蓝芥(Thellugiella parvula)PIN3在更多的位点出现氨基酸的替换,这可能是导致十字花科不同种属PIN3蛋白的功能和活性出现差异的原因。     

Protein structure prediction and structural genomics

Genome sequencing projects are producing linear amino acid sequences, but full understanding of the biological role of these proteins will require knowledge of their structure and function. Although experimental structure determination methods are providing high-resolution structure information about a subset of the proteins, computational structure prediction methods will provide valuable information for the large fraction of sequences whose structures will not be determined experimentally. The first class of protein structure prediction methods, including threading and comparative modeling, rely on detectable similarity spanning most of the modeled sequence and at least one known structure. The second class of methods, de novo or ab initio methods, predict the structure from sequence alone, without relying on similarity at the fold level between the modeled sequence and any of the known structures. In this Viewpoint, we begin by describing the essential features of the methods, the accuracy of the models, and their application to the prediction and understanding of protein function, both for single proteins and on the scale of whole genomes. We then discuss the important role that protein structure prediction methods play in the growing worldwide effort in structural genomics.     

Evolution of proteolytic enzymes

Proteolytic enzymes have many physiological functions, ranging from generalized protein digestion to more specific regulated processes such as the activation of zymogens, blood coagulation and the lysis of fibrin clots, the release of hormones and pharmacologically active peptides from precursor proteins, and the transport of secretory proteins across membranes. They are present in all forms of living organisms. Comparisons of amino acid sequences, three-dimensional structures, and enzymatic reaction mechanisms of proteases indicate that there are distinct families of these proteins. Changes in molecular structure and function have accompanied the evolution of proteolytic enzymes and their inhibitors, each having relatively simple roles in primitive organisms and more diverse and more complex functions in higher organisms.     

关岭牛FABP3和FABP4基因的分子特征及其组织表达分析

【目的】探究关岭牛心脏型脂肪酸结合蛋白（FABP3）和脂肪型脂肪酸结合蛋白（FABP4）基因的分子特征及其在不同年龄段和不同组织中的表达差异,为揭示牛FABP3和FABP4基因对脂肪酸的调控作用机制提供理论依据。【方法】通过RT-PCR扩增关岭牛FABP3和FABP4基因蛋白编码区（CDS）序列,采用ProtScale、ProtParam、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM-2.0、SignalP-5.0及NetPhos-3.1等在线软件进行生物信息学分析,同时以实时荧光定量PCR检测FABP3和FABP4基因在3日龄关岭犊牛、24月龄关岭牛（成年）及24月龄杂交牛（关岭牛×利木赞牛）各组织中的表达情况。【结果】关岭牛FABP3、FABP4基因CDS序列全长分别为402和399 bp,对应编码133和132个氨基酸残基,其蛋白二、三级结构以无规则卷曲和延伸链为主,均无跨膜结构域和信号肽,且为稳定的亲水性蛋白。关岭牛FABP3、FABP4氨基酸序列分别存在26和21个磷酸化位点,其中又以苏氨酸磷酸化位点为主;关岭牛FABP3和FABP4蛋白与FABP1、FABP6、过氧化物酶...     

胃泌素和胆囊收缩素及其受体氨基酸序列信息学比较分析

【目的】胃泌素(GAS)和胆囊收缩素(CCK)具有较多相似性,但两种激素与其受体(CCK-A和CCK-B)亲和力不同,研究利用生物信息学的方法,比对羊GAS和CCK及其受体氨基酸序列与其它动物序列的不同,为不同动物这两种多肽及其受体蛋白抗原设计和活性多肽筛选等提供参考。【方法】通过UniProt数据库检索各种动物GAS和CCK及其受体氨基酸序列进行比对,并进行全氨基酸序列进化树分析。【结果】除了鸡和鱼,其他动物GAS的C-端7个氨基酸完全相同;除了豚鼠外,CCK的C-端10个氨基酸序列完全相同;羊与牛的GAS-34及CCK-33氨基酸序列完全相同。羊与牛,大鼠与小鼠、狗与猫的CCK-A和CCK-B均分别在同一个分支上;从GAS和CCK及受体全氨基酸序列(包括信号肽和原肽)来看,禽类和鱼类序列同哺乳动物差距均较大;绵羊CCK-A与CCK-B氨基酸序列相似性仅为45.094%。【结论】GAS和CCK的C-端氨基酸序列在不同动物之间均具有高度的保守性,而N-端为变化区域。     

苹果SBP基因家族生物信息学分析

首先利用生物信息学方法对苹果42条SBP蛋白序列的系统发生和SBP基因组定位进行分析,然后对其氨基酸组成成分、理化性质以及二级和三级结构进行预测和分析,同时还分析了苹果与拟南芥的SBP基因家族之间的联系。结果显示着42条蛋白序列与拟南芥16条SBP蛋白序列一起被分成了7个亚族,拟南芥与苹果SBP基因间具有较高的保守性。基因组定位结果显示42条SBP基因分布在12条染色体上。研究还发现不同亚族间氨基酸数目、氨基酸序列疏水性存在一定的差异;二级结构预测分析发现,42条氨基酸序列以随机卷曲和α-螺旋为主要组成部分,而且42条氨基酸序列三维结构相似。     

商陆PaHAK1与拟南芥HAK/KUP/KT家族基因的比较分析

为探明商陆高亲和性K+转运体基因(Pa HAK1)的结构、功能及商陆耐低钾的原因,分析比较了商陆Pa HAK1和拟南芥HAK/KUP/KT家族基因中15个基因编码的高亲和性钾离子转运体氨基酸序列、蛋白质结构及其理化性质。结果表明:HAK基因家族编码蛋白均定位于细胞膜上,含有多个跨膜结构且跨膜结构域是蛋白质的保守结构域;Pa HAK1与At KUP3的跨膜结构十分相似,低钾胁迫下Pa HAK1和At KUP3的高表达与其高亲和钾转运吸收功能密切相关。系统进化树分析结果表明,Pa HAK1与拟南芥HAK基因家族中At KUP8亲缘关系最近,其氨基酸序列相似度为76.98%,推测Pa HAK1还可能通过维持细胞内高水平钾量在水分胁迫下发挥重要的调节作用。     

水稻种子胚乳蛋白的双向电泳分析技术

为探讨水稻灌浆期间与籽粒充实相关蛋白表达的变化，建立了一套适于水稻种子胚乳蛋白双向电泳分析技术，探讨了胚乳蛋白的提取、纯化以及双向电泳的一些关键技术．结果表明，通过乙醇铵沉淀、高压等电聚焦和两步平衡等方法可以获得较好的分析结果，获得胚乳蛋白斑点数约350个，等电点范围在3．0～9．0，其中大部分集中在4．0～7．0．