PCR方法快速鉴别绞股蓝与乌蔹莓

建立绞股蓝与乌蔹莓2种中药相互鉴别的特异性PCR方法,利用SYBR Green I染料法建立对绞股蓝与乌蔹莓的快速鉴别方法。采集不同产地的绞股蓝与乌蔹莓各9份,通过对其叶绿体DNA中trnL-F片段进行扩增、测序,进行多重序列比对后,根据其变异位点设计相互鉴别的特异性引物,建立特异PCR鉴别方法,并通过加入SYBR Green I染料法建立对2种中药进行快速检测方法,本研究建立了对绞股蓝与乌蔹莓2种中药进行分子鉴别方法,并建立了荧光快速检测方法。     

基于rbcL条形码的鸡血藤真伪鉴别

为了建立鸡血藤基于rbcL基因的DNA条形码鉴别体系,为其资源保护和用药安全提供分子依据,采用商业试剂盒提取鸡血藤样品的基因组DNA,以及rbcL通用引物进行PCR扩增和测序;并从GenBank数据库获取鸡血藤混伪品的rbcL基因序列。采用DNAMAN、Clustal X软件进行序列比对分析,MEGA 5.1软件构建系统发生树。结果表明:获取的鸡血藤及其混伪品rbcL序列均为498 bp,GC含量分布在40.0%~44.4%间,存在64处变异,种间遗传距离远远大于种内遗传距离。基于rbcL基因的系统发生树能很好地区分鸡血藤及其混伪品。因此,rbcL基因可用作鸡血藤及其混伪品鉴别的DNA序列。     

广西斑地锦及其混淆品DNA条形码分子鉴定

为鉴定斑地锦（Euphorbia maculata L.）及其混淆品,以广西采集的41份斑地锦及其混淆品为研究对象,提取其基因组DNA,对各个样品的条形码rbcL和psbA-trnH序列进行扩增并测序,与GenBank下载的13份斑地锦及其混淆品rbcL和psbA-trnH序列进行了分析比对,计算了斑地锦及其混淆品的种内、种间遗传距离并采用邻接法构建了系统发育树。结果发现,斑地锦种内遗传距离明显小于其与混淆品的遗传距离,系统发育树中斑地锦样品聚为单系并能够与其混淆品明显区分开,这表明rbcL和psbAtrnH序列可用于斑地锦及其常见的混淆品的鉴别。     

基于ITS2的北沙参药材及其伪品的分子鉴定

利用内部转录间隔区2(ITS2)条形码来鉴定河北某药材市场北沙参的真伪品,探讨分子方法鉴定北沙参药材真伪品的可行性。提取12份北沙参样品的DNA,利用ITS2引物进行PCR扩增,对扩增产物进行双向测序,利用CodonCode Aligner软件进行序列拼接。从Genbank下载13条北沙参序列,利用MEGA 6.0分析比对25份序列,计算其种间、种内的Kimura双参数遗传距离(K2P距离)以及各序列的变异位点并进行聚类分析,利用RNA多重排列(locARNA)来预测北沙参及其伪品的二级结构。12份样品中10份为北沙参,1份是川明参,1份为祁木香。ITS2序列可以较好地区分北沙参及其伪品,可作为北沙参鉴定的有效方法而加以推广。北沙参的DNA条形码鉴定体系的建立,为DNA条形码技术在临床及市场监管领域的实践应用提供了理论基础。     

中国兰中几种常见DNA条形码标准序列的PCR扩增方法

[目的]DNA条形码技术是分子鉴定的最新进展之一,为了研究中国兰的DNA条形码技术,实现中国兰的快速鉴定。[方法]该文通过电泳成像技术、BLASTN核苷酸相似序列检验等分析方法,对一种中国兰ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等常用DNA条形码标准序列PCR扩增的方法进行了可行性检验。[结果]该方法可以在中国兰中有效扩增ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等条形码序列,并通过双向测序获得序列信息,ITS标准序列由于引物存在非特异性扩增,需要重新设计合适的引物。[结论]利用该方法,可以有效获得中国兰中ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等几种常见DNA条形标准序列,并大大简化了PCR反应操作步骤,为进一步研究中国兰的DNA条形码技术提供了参考和借鉴。     

两面针与混伪品及近缘种DNA条形码鉴定研究

[目的]探讨DNA条形码技术对两面针真伪鉴定的可行性,为两面针种质资源的鉴定提供参考.[方法]对两面针及其常见混伪品和同属近缘种（10种31份样品）进行DNA提取、PCR扩增和双向测序,所得序列经CodonCodeAligner软件处理和人工校对,采用TaxonGap法比较rbcL、trnH-psbA和ITS2等3条序列的物种鉴定力大小;选择适用条形码在不同物种样品范围内进行分析,检查种内种间距离变化情况.[结果]ITS2和tmH-psbA两条序列对10个试验物种的鉴定效率均为100.0％,rbcL在实验物种范围内不存在最小种间遗传距离;ITS2序列在样品鉴定范围由12个物种33个数据扩大为33个物种132个数据时,鉴定成功率从100.0％下降至84.8％,种内变异大于种间变异的比例由71.4％上升至90.1％.[结论]ITS2和trn H-psbA序列可作为两面针真伪鉴定的标准条形码,实际应用中应注意确定物种鉴定样品数及种内充分取样.     

基于柑橘及其近缘属植物DNA条形码的叶绿体编码序列筛选

 【目的】通过对柑橘及其近缘属植物叶绿体4种编码序列的测定分析,获得能进行DNA条形编码的特征序列,为进一步研究叶绿体非编码区序列奠定基础。【方法】对柑橘及其近缘属植物59份样品进行matK、rpoB、rpoC1、rbcL测序,序列比对与人工校正,计算属间、种间、种内的遗传距离,比较序列间的差异,建立系统发育树。【结果】4种序列中,matK序列在属间、种间差异最大,与其它序列相比具有显著性差异,rbcL序列次之,而rpoB、rpoC1序列两者间没有显著性差异。【结论】matK序列是柑橘及其近缘属植物DNA条形码的未来研究中一个重要的候选片段。     

荨麻科植物DNA条形码的筛选

[目的]评价不同DNA条形码候选序列对荨麻科植物的鉴别能力,为荨麻科植物鉴定提供参考.[方法]使用ITS、matK、rbcL和psbA-trnH绪列的通用引物对荨麻科植物进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增效率、测序成功率,分析获得序列的碱基组成及变异,比较种间和种内变异的差异,并对条形码间距进行评估.[结果]psbA-trnh序列在荨麻科植物13个种30个样品中的扩增成功率最高(100.0%).psbA-trnH的有效序列获得率最高,为95.4%,ITS为92.3%,rbcL为90.1%,matK为零.ITS序列种间遗传距离范围为0~0.508,psbA-trnH序列为0~0.522,rbcL序列为0~0.532.ITS序列在种间、种内的差异变异及条形码间距较rbcL与psbA-trnH具有更明显的优势.ITS序列构建的系统发育树中不同物种形成单系分支的百分比最高,其次为psbA-trnH、rbcL序列.聚类结果表明,MP法的聚类效果最好,其次为UPGMA法、ML法,NJ法最不理想.[结论]荨麻科植物种间变异明显大于种内变异,DNA条形码适用于荨麻科植物种水平上的鉴定;3个候选序列中无任何一个序列可完全鉴别出不同种类的荨麻科植物,ITS、rbcL与psbA-trnH可作为鉴别荨麻科植物的DNA条形码序列组合.     

濒危龙树科植物DN A条形码鉴定方法

为了建立濒危龙树科植物DNA条形码鉴定方法,本研究选取rbcL、matK、ycf1b等3对引物对9种21份龙树科植物进行DNA提取、序列扩增及产物测序,比较序列扩增效率和测序成功率;应用DNASTAR Lasergene软件对测得的双向序列进行拼接;使用ME GA-X软件进行序列比对,分析种内和种间变异;使用邻接法构建系统聚类树.结果表明,ycf1 b序列可以区分龙树科4个属的植物,聚类效果好,种间存在可靠序列差异,可作为龙树科植物DNA条形码鉴定的有效序列片段.     

基于近红外光谱与DPLS的潲水油快速鉴别方法

潲水油回流餐桌等食品安全问题越来越受到社会关注,探寻准确、快速、简便、高效且成本低廉的潲水油鉴别新方法成为食用油安全性能检测的新要求.对收集的82份潲水油和合格食用油样品进行了理化检测,鉴别出潲水油样品37份,合格油样品45份.从82份样品中随机选出24份样品作为第一组,余下58份样品作为第二组,以第一组24份样品作为校正集,建立判别偏最小二乘法(DPLS)模型,鉴别第二组58份样品,总体鉴别正确率为86.21%;再以第二组58份样品作为校正集,建立DPLS模型,鉴别第一组24份样品,总体鉴别正确率为95.83%.研究表明,基于近红外光谱与DPLS的潲水油快速鉴别方法可行,具有较好的鉴别效果.     

一种基于聚合酶链式反应检测SNP的方法

SNP是具有广泛利用潜力的第3代分子标记,本文旨在开发一种利用PCR技术快速检测SNP的方法。设计思路是:根据已知SNP位点设计2条特异正向引物,其最后一个碱基分别与已知SNP的2个碱基相同,同时在1条引物的5′端添加1段20 bp左右的其他物种的特异序列(如细菌DNA序列),然后选择1条合适的反向引物;最后同时加入3条引物,通过梯度PCR选择合适的退火温度进行PCR反应。利用这一方法成功将玉米的ZDS基因定位在玉米第7染色体短臂7.02 Bin。这种检测SNP的方法设计简单,费用低廉,尤其适合SNP标记的分子标记连锁图构建或者基因定位。     

基于ITS2和SNP技术鉴定浙江铁皮石斛的初步研究

铁皮石斛以营养价值和保健功效备受消费者青睐,但不同品种和不同品质铁皮石斛的区分和鉴别存在困难,急需建立一种快捷、准确、高效的鉴定方法.以浙江省12个铁皮石斛和其他省的10个石斛为材料,选取DNA条形码ITS2,优化扩增体系,对扩增产物进行测序,经序列比对与分析,获取浙江铁皮石斛DNA条形码ITS2中的特异性SNP位点;...     

RAD-seq技术在植物物证个体认定中的应用

在犯罪案件现场发现与嫌疑人(或受害人)相关联的植物物证,鉴定它们来源和进行个体识别,可为案件的调查取证提供有价值的证据或线索.该研究采用一种RAD-seq技术对18个桂花样品(15个已知样本、3个盲测样本)进行DNA建库和高通量测序,序列多态性分析,评估其遗传多样性,并用基于SNP和基于k-mer频谱的2种比较分析方法探讨了RAD-seq数据用于个体识别的科学性和对植物物证进行同一性认定的可行性.结果表明,2种方法都能成功识别3个盲测样本.相比较而言,基于k-mer频谱的方法在稳定性和自动化程度上要优于基于SNP亲缘关系树的分析方法,更易推广到公安物证鉴别应用中.RAD-seq技术结合该文的分析方法能够识别出未知植物物证样品A,B和C分别对应于植物物证桂花1,4和11,实现了对案件中关联植物物证进行精确检验鉴定的方法和一个小型鉴定实例,但其识别能力有待扩展到更大样本集和更多物种中.     

山羊TGFB3基因的多态性及生物学信息分析

为了解山羊TGFB3基因的多态性,并为优秀山羊品种的选育提供理论依据,选择牛TGFB3基因组序列(NM_001101183)设计1对特异性引物,采用DNA池PCR直接测序法快速检测黔北麻羊、内蒙古白绒山羊和关中奶山羊3个山羊品种的TGFB3基因的多态性.结果表明,只在黔北麻羊TGFB3基因第1外显子212 bp处发现1...     

贝类奥尔森派琴虫可视化LAMP检测技术的建立与应用

根据环介导等温扩增(LAMP)技术原理,针对奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)的5.8 S核糖体RNA与内转录2间隔区序列,设计了6条特异性LAMP扩增引物,分别为两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。通过对反应条件的优化,建立了一种适用于贝类奥尔森派琴虫的可视化LAMP检测技术。该技术只对奥尔森派琴虫发生扩增反应,产生黄绿色荧光扩增产物,对其他对照DNA样品无扩增反应,不产生黄绿色荧光。对F3和B3外引物扩增产物进行测序分析,其序列与Gen-Bank中奥尔森派琴虫序列一致,检测结果具有高度特异性。对奥尔森派琴虫质粒DNA的最低检测量为100 fg。用该项LAMP技术与OIE公布的派琴虫PCR检测技术分别对50份分别来自华东及华南沿海地区的牡蛎样品进行检测,同时对PCR阳性样品进行测序分析。结果 LAMP检测到2份奥尔森派琴虫,PCR方法检测到9份派琴虫。测序分析结果表明,PCR方法检测到的9份派琴虫阳性样品中有2份为奥尔森派琴虫,其结果与LAMP检测结果相符,说明该技术适用于贝类样品奥尔森派琴虫的检测。     

DNA条形码基因ITS·ITS2及rbcL在苍耳属可采用相同的PCR条件（英文）

[目的]为植物DNA条形码标准基因筛选研究提供参考,减少植物DNA条形码研究中的工作量。[方法]对7种苍耳属植物ITS、ITS2及rbcL基因采用相同的扩增条件（95℃4 min;[35 cycles：94℃30 s;52℃45 s;72℃45 s];72℃10 min;4℃保存）。[结果]3种DNA条形码基因同时成功扩增。[结论]这说明植物DNA条形码基因中ITS、ITS2及rbcL的PCR条件存在合并可能性。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

基于HRM获得与桃Tssd紧密连锁的SNP标记

【目的】植物中,SNP标记具有分布广泛、分辨率高、共显性和多态性高等特点,是遗传研究的常用分子标记。桃全基因组测序完成,获得了大量SNP位点。利用现有的SNP数据进行简单、快速的SNP基因分型是基因定位、品种鉴定和图谱构建等后续研究的基础。文章拟建立采用高分辨率熔解曲线进行不同类型SNP的基因分型方法,以获得与桃温度敏感半矮生型基因紧密连锁的分子标记。【方法】以普通生长型(ST)单株97-32-46为母本,温度敏感半矮生型单株03-94-2(Tssd)为父本进行人工杂交,利用其分离群体96个后代单株为研究材料。在定位目标基因的区间内开发连锁和不同类型的SNP标记的基础上,采用高分辨率熔解曲线进行SNP的基因分型并获得与目标性状紧密连锁的SNP标记。【结果】明确了DNA模板和Mg~(2+)是影响基因分型的关键因子,并确立了反应体系最佳浓度区间。在15μL反应体系中模板DNA的量低于5.0 ng时或Mg~(2+)浓度低于1.6μmol·L~(-1)时则不能完成PCR扩增和基因分型;根据亲本基因型和表型一致的SNP位点设计引物,扩增片段长度在140 bp左右。高分辨率熔解曲线分析可对由单个核苷酸变异引起的4种不同类型的SNP(A/T、A/G、A/C和C/G)进行基因分型,并正确区分了温度敏感半矮生型和普通生长型,与进行Sanger测序鉴定的结果一致。采用96孔板对温度敏感半矮生型和普通生长型各48个分离后代单株进行了PCR扩增和基因分型,确定了遗传距离。分型结果表明高分辨率熔解曲线分析技术可以将96个样杂交后代单株分为温度敏感半矮生型和普通生长型2种,正确地区分了A/A基因型和A/T基因型。在96个样品中仅1个没有成功扩增,在温度敏感半矮生型和普通生长型中各存在1个重组单株。获得与温度敏感半矮生型基因紧密连锁的SNP标记,遗传距离为2.11 cM。【结论】建立了基于高分辨率熔解曲线分析的SNP基因分型。尽管高分辨率熔解曲线分析技术无法区分两种不同纯合类型的SNP变异,但仍不失为区分已知变异SNP的有效方法。在已经获得桃大量SNP的基础上,该体系可用于桃的基因定位、遗传多样性和品种鉴定等研究。     

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。